Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
при определении молекулярных масс дает аналитическое
ультрацентрифугирование в растворах ДСН с последующим измерением
связывания детергента [!]• Если необходимо, чтобы белок находился в
мономерной форме в неионном детергенте, можно применить описанную ниже
методику для белковых комплексов. Гораздо сложнее ответить на вопрос,
достигается ли в ДСН полная деполимеризация. Если такое сомнение
возникает, необходимо применить совместно гель-электрофорез в ДСН,
аналитическое ультрацентрифугирование в различных денатурирующих условиях
и количественный анализ концевых групп.
2.2. Молекулярная масса белковых комплексов
2.2.1. Химическое сшивание
Техника химического сшивания белковых комплексов в ин-тактной мембране и
последующее определение молекулярной массы сшитых агрегатов с помощью
гель-электрофореза в ДСН
Биофизические подходы
позволяют получить информацию о размерах комплекса в нативных условиях,
что весьма важно для исследования организации мембранных белков.
Детальное описание этой методики дано в гл. 6; введение в проблему можно
найти также в статье [3]. Отметим два важных аспекта такого подхода. 1.
Хотя положительный результат - образование сшивки между двумя белковыми
молекулами - может служить достаточно веским доводом в пользу
существования комплекса in vivo, отрицательный результат не всегда
означает, что ассоциация отсутствует.
2. Изучая мембранные системы, трудно или почти невозможно' ответить на
вопрос, образуются ли стабильные комплексы или устанавливается
динамическое равновесие. В случае солюбилизированных комплексов эту
дилемму можно решить, проанализировав влияние концентрации белка на
процесс образования сшивок. С другой стороны, образование сшивок в
результате случайных столкновений между белковыми молекулами, ранее
считавшееся весьма вероятным, по-виднмому, все-таки не является столь
частым событием [4, 5].
2.2.2. Аналитическое ультрацентрифугирование
Аналитическое ультрацентрифугирование - изучение движения и распределения
растворенных макромолекул в гравитационном поле - представляет собой
классический метод определения их молекулярной массы. Хотя этот способ
сейчас менее популярен, чем раньше, он, вероятно, остается лучшим методом
определения молекулярной массы комплексов мембранных белков, особенно
если количество белка ограниченно. Детальное описание этого метода можно
найти в другой книге данной серии [6]. Здесь мы кратко остановимся лишь
на тех аспектах, которые особенно важны при исследовании мембранных
белков.
1. Если центрифуга снабжена УФ-сканирующей системой, можно изучать
растворы белков с концентрацией менее 100 мкг/мл (при объеме пробы --150
мкл на пробирку). Это позволяет не только уменьшить необходимое
количество чистого материала, но и в большинстве случаев считать раствор
идеальным, что значительно упрощает обработку экспериментальных данных.
2. Если исследуются периферические мембранные белки, которые можно
изучать в отсутствие детергентов, то их молекулярную массу можно
определить, измеряя скорость седиментации и коэффициент диффузии, с одной
стороны, и проводя равновесный седиментационный анализ - с другой. Для
интегральных мембранных белков, требующих присутствия неионных
детергентов, наиболее удобен анализ седпментационного равновесия,
поскольку при этом проще всего учесть вклад связанного с белком
детергента.
23 -1488
842
Глава 8
3. Опыты по определению седиментационного равновесия белков в неионных
детергентах позволяют определить массу как комплекса белок - детергент,
так и чистого белка. Для этого варьируют плотность растворителя,
используя различные смеси H2O/D2O. Молекулярную массу чистого белка можно
определить, либо используя растворитель, плотность которого сопоставима с
плотностью детергента, либо экстраполируя данные к этой плотности. Для
этого, правда, необходимо еще знать удельный объем белковой глобулы.
Чтобы можно было подобрать соответствующую плотность растворителя,
плотность детергента должна составлять 1,0-1,1 г/мл. К счастью, для
большинства стандартных неионных детергентов, включая детергенты серии
бридж и тритон Х-100, это условие выполняется [1].
4. Смесь олигомерных агрегатов одного полипептида или белковых комплексов
можно изучать, анализируя с применением метода наименьших квадратов
профиль зависимости концентрации от радиуса после установления
седиментационного равновесия. Это позволяет оценить размеры олигомерных
форм и их долю. Кроме того, проводя эксперименты при различных
концентрациях белка или при разных скоростях центрифугирования, можно
выяснить, являются ли олигомеры стабильными или находятся в равновесии
друг с другом [7]. На рнс. 8.1 представлены результаты эксперимента по
аналитическому ультрацентрифугированию.
2.2.3. Методы, основанные на рассеянии излучения растворами
Для определения молекулярной массы частиц можно использовать метод
малоуглового рентгеновского рассеяния или рассеяния тепловых нейтронов
