Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
|Г(аЬ'Ылг] hsch2ck2oh (1РаЬЦ ©
> -> — [F(ab )2]Ar F F(ab^ .©
IF(ab'52]E J j
Способность белка А стафилококка образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом антител используют для получения конъюгатов, в котором фермент, предварительно сшитый каким-либо химическим способом с белком А, соединяется с Fc-фрагментом антител через белковую «ножку»:
@ + © —-0~© - ©—©...©
Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется ctfa- 1015 М.-1 по схеме
© + ©
© + ©-— ©—©
Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат.
• Все описанные выше нековалентные методы синтеза конъюгатов имеют следующие преимущества: 1) они просты в проведении;
2) в конъюгате практически полностью сохраняется ферментативная и иммунологическая активность; 3) метод позволяет получить универсальный реагент для ИФА различных антигенов.
191
Синтез конъюгата антител с щелочной фосфатазой через авидин-биотиновый комплекс.
а. К 250 мкл раствора (1 мг/мл в диметилсульфоксиде) сукцинимидного эфира биотина, полученного из биотина, оксисукцинимида и дициклогексилкар-бодиимида, добавляют 250 мкл раствора (10 кг/мл) IgG и 750 мкл карбонатного буфера (pH 9,2). Разбавляют смесь 3,5 мл PBS, инкубируют 3 ч при комнатной температуре и днализуют 3 дня против PBS.
б. К 15 мг щелочной фосфатазы добавляют 100 мкл раствора авидина (10 мг/мл) и днализуют в течение ночи против PBS. Добавляют 10 мкл глута-рового альдегида до концентрации 0,2% в конечном объеме, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, разбавляют до 1 мл PBS и диализуют в течение ночи против PBS.
в. Разбавляют конъюгат антител с биотином в соотношении 1/10 000 в PBS, содержащем 0,05% твин-20 и 2% сыворотки лошади, и добавляют равный объем конъюгата авидина с щелочной фосфатазой в разбавлении 1/500 в PBS. Смесь инкубируют 1 ч при 37 °С. Полученный комплекс стабилен при 4 °С не менее недели,
§ 3. Получение конъюгатов гаптен — фермент
Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами. Однако есть ряд особенностей, которые необходимо учитывать при проведении синтезов. Во-первых, многие гаптены плохо растворимы в водных растворах и поэтому получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата. Во-вторых, бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента, а это приводит к высоким фоновым реакциям, а поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом. В-третьих, для сохранения иммуногенных свойств гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную «ножку», содержащую 5—6 атомов цепи.
Кроме того, должно быть тщательно выбрано место пришивки гаптена к ферменту, так как это влияет на специфичность анализа. Показано, что специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент—гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен—носитель, используемым для иммунизации.
Если при получении конъюгатов гаптен—носитель для иммунизации животных стараются пришить ~ 10 молекул гаптена на молекулу белка, то конъюгат гаптен—фермент должен отвечать составу 1:1. Поэтому для синтеза конъюгатов гаптен—фермент в настоящее время в основном используют методы с применением гетеробифункциональных реагентов.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Самыми распространенными методами син-
192
теза конъюгатов гаптен — фермент являются методы, основанные на образовании пептидной связи между аминогруппой фермента и карбоксильной группой гаптена, предварительно активированной каким-либо реагентом:
©-C-Z + NH2-© -hz~~ ©—С NH—0
О о
Метод смешанных ангидридов. При взаимодействии гаптенов, содержащих СООН-группу, с изобутилхлорформиатом в безводном органическом растворителе при пониженной температуре легко получаются смешанные ангидриды, которые без выделения затем взаимодействуют с ЫН2-группами лизиновых остатков фермента:
(г)—СООН + С1СООСН2СН(СН3)2 jjT)—СООСООСН2СН (СН3)2]-
? ®~NH_2^ (?)— CONH—(Ё) + С02 + НОСН2СН(СН3)3
Этим методом получают конъюгаты большинства гаптенов. Однако даже при 20—30-кратном избытке гаптена относительно фермента выход конъюгата не превышает 20—30%. Реакцию обычно проводят с добавлением основания (триэтиламин, трибутиламин) для удаления образующейся НС1.
Для разрушения слабой сложноэфирной связи, которая побочно возникает между активированной карбоксильной группой гаптена и тирозиновым остатком фермента, а также для удаления избытка непрореагировавших реагентов реакционную смесь после завершения реакции обрабатывают гидроксиламином.
Синтез конъюгата о-(карбоксиметил)морфина с малатдегидро-геназой.
8 мг малатдегидрогеназы из митохондрий выделяют центрифугированием из суспензии фермента в насыщенном растворе (NH4)2S04. Осадок растворяют в
0,25 мл воды, диализуют 18 ч при 0°С против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,5, и доводят объем раствора фермента до 1 мл буфером, содержащим 0,1 М фосфата натрия и 0,05 М карбоната натрия, pH 9,0. К суспензии 514 мг (1,5 ммоль)
