Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Иммобилизованные на кремнеземных носителях антитела длительное время сохраняют способность специфически взаимодействовать с антигеном.
Иммобилизация антител на сефа-дексе, сефарозе, целлюлозе. Широко используемые в биохимических лабораториях носители сефадекс G-200, се-фароза 4В, карбоксиметилцеллюлоза могут успешно использоваться для иммобилизации антител. Чаще всего полисахаридные носители активируют бромцианом. Схема реакции:
го связывания глобулиновой фракции антител с 0,5 г силохрома G=20 М, активированного глутаровым альдегидом, 20 °С, pH 7,4
.ОН
а) < + BrCN хОН
полисахарид
<
О—C=N
ОН
^OCONHj
R\0H ^
^ инертный карбонат
/0\
<0>=NH (2) активный имидокарбонат
6) (2) + 1МН2—(Ат)
< /С No-^
? Ov
=N—^т)
—NH—(а^
'ОН
NH
r/°-s-nh-©
ОН
(3)
(4)
(5)
205
Взаимодействие полисахарида с бромцианом приводит к образованию нереакцио'нноспособных эфиров карбаминовой кислоты (1) и активных имидокарбонатов (2). Последние в слабощелочной среде быстро реагируют с аминогруппами белка, образуя N-замещенные имидокарбонаты (3), лроизводные изомочевины (4) и N-замещенные эфиры карбаминовой кислоты (5).
Методика.
1. 200 мг сефадекса G-200 выдерживают в течение 20 ч в 12 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 4 мл водного раствора, содержащего 200 мг BrCN. (Соблюдать осторожность! Реагент обладает раздражающим и сильным токсическим действием.) Раствор доводят до pH 11 1 М NaOH и поддерживают это значение pH на автоматическом титраторе. Суспензию размешивают при 23—26 °С. Активированный гель переносят на стеклянный фильтр, отсасывают и промывают 300 Мл холодного 0,1 М гидрокарбоната натрия и 0,3 М раствором гидробикарбоната калия.
Аналогичным или модифицированным способом активируют сефарозу.
2. К 1 г активированного носителя добавляют IgG-функцию антисыворотки или выделенные антитела в 0,1 М NaHC03 (коммерческий препарат BrCN-сефа-розы предварительно замачивают в 10 мМ НС1 и промывают 0,1 М NaHC03). Инкубируют в течение суток при мягком перемешивании при комнатной температуре. Промывают иммуносорбент последовательно 1 М этаноламином (2 ч для блокировки свободных активных групп носителя), 0,5 М NaHCOs, 0,2 М ацетатным буфером (pH 4,0), а затем 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl (или другим буфером, который впоследствии будет использован в анализе). Хранят иммупосорбент в том же буфере при +4“С.
Сочетание адсорбции и ковалентного связывания при иммобилизации антител на пластиковых планшетах и пробирках для ИФА.
Наиболее широко применяемыми носителям. в твердофазном ИФА являются 96-луночные планшеты и пробирки из оптически прозрачного полистирола, поливинилхлорида или других полимерных материалов, с внутренней поверхностью которых связываются антитела. Как отмечалось ранее, в большинстве случаев иммобилизацию проводят адсорбционно, что упрощает процедуру, но снижает прочность связи белка с носителем. Увеличение прочности связывания может быть достигнуто при ковалентном закреплении антител на пластике.
Существующие способы ковалентной иммобилизации белков и ферментов на полистироле и его производных в основном разработаны для макропористых носителей и полистирольных гелей, используемых в ионообменной хроматографии. Сложность ковалентной пришивки для целей ИФА состоит в том, что модификации должно подвергаться готовое штампованное изделие из оптически прозрачного непористого полистирола (или другого полимера). При этом оптические свойства носителя в процессе активации не должны ухудшаться, так как на конечной стадии анализа лунки планшета или пробирка служат кюветой Для фотометриро-вания продукта ферментативной реакции. С другой стороны, условия модификации должны исключать изменение однородности поверхности носителя (частичное растворение «набухание» полимера
206
и 'В'. Д.), вызываемое многими органическими растворителями. В связи с этим используемые подходы для ковалентного закрепления антител на оптически прозрачных полимерных носителях для ИФА весьма ограничены.
• Наиболее простой метод заключается в предварительной обработке планшетов или пробирок из полистирола или поливинилхлорида водным раствором глутарового альдегида. Добавляемые затем антитела ковалентно связываются с активированным носителем. Механизм активации пластика альдегидом детально не изучен. Не исключено, что глутаровый альдегид, в основном существующий в форме олигомеров, просто прочно адсорбируется на поверхности полимера. Это согласуется с данными о минимальной фиксирующей способности мономерной формы альдегида. В связи с этим употребляемый в литературе в данном случае термин «ковалентная иммобилизация» является некорректным, так как ковалентная связь образуется только между белком и сшивающим антигеном, но не между белком и носителем. Однако экспериментально показано, что прочность связывания антител с полимером в результате подобной процедуры возрастает. Например, при адсорбции антител против HBs-антигена на планшетах из поливинилхлорида в процессе инкубации с сывороткой крови десорбируется до 43%, а при связывании через глутаровый альдегид— до 12% антител соответственно.
