Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 73

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 115 >> Следующая

SIAB дает конъюгаты с большим выходом и высокой специфичностью, однако пока не нашел широкого применения.
Синтез конъюгата кроличьих антител против IgG-овцы с р-D-галактозидазой с помощью SIAB.
К раствору 3 мг (2,6-10-8 М) кроличьих лнтител против IgG-овцы в 3 мл О,ОС М фосфатного буфера, pH 7,0, добавляют 30 мкл раствора SIAB (3,6 мг/мл в тетрагидрофуране) и инкубируют в темноте в течение ночи при комнатной температуре. К раствору добавляют 30 мкг (4,5-10-2 М) глицина для разложения избытка SIAB и инкубируют в темноте 3 ч при комнатной температуре. Затем к охлажденному до 4 “С раствору добавляют Ы0-9 М Р-?)-галактознда-зы, доводят pH реакционной смеси до 7,8 и поддерживают его таким в течение 2 дней. Далее к реакционной смеси добавляют 4-10-3 М 2-меркаптоэтанола для удаления непрореагировавших веществ и инкубируют 3 ч при комнатной температуре. Полученный конъюгат разбавляют глицерином (50%).
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится также N-оксисукцинимидный эфир 3(-2-пиридилдитио) пропионо-вой кислоты (SPDP). С помощью SPDP 2-пиридилдисульфидные группы вводятся как в молекулу IgG, так и в молекулу пероксидазы хрена. Затем 2-пиридилдисульфидное производное IgG восстанавливается дитиотреитолом с образованием' SH-производного, которое далее реагирует с модифицированным ферментом путем ди-сульфидного обмена:
(SIAB)
188
1. @)—
NH, +
Л
N—О—COCH2CH2SS
V

(SPDP)
сн.,—сн—сн—сн,
1н он 1н
Ce-Ct
2. (fix)—NH, + SPDP
(nx)—nhcoch2ch2
Лл г/
,—SS—({ V + ^N—OH \
3. nhcoch2ch2—ss—^ + hsch2ch2conh—@ -—
- (n^—nhcoch,ch2—ss—CHjCH2eoNH—^ . hshQ
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG с помощью SPDP.
К раствору 10 мг ПХ в 2 мл 0.1 М фосфатного буфера, pH -7,5, содержащего 0,1 М NaCl, добавляют по каплям при перемешивании 400 мкг SPDP, растворенного в 0,5 мл этанола.-Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин и затем хроматографируют на колонке с сефадексом G-25 (1,6X25 см), уравновешивают фосфатно-солевым буфером (PBS) и собирают фракции, соответствующие первому пику. Аналогичным образом проводят реакцию 10 мк IgG и 10—15 мкг SPDP. Модифицированный фермент обрабатывают дитиотреитолом (25 мМ) Н вновь хроматографируют на колонке с сефадексом G-25. Смешивают растворы пероксидазы, содержащей SH-группы, и IgG, содержащего 2-пиридил-сульфидные группы, н инкубируют при 4 “С в течение 18 ч. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с Со-А-сефарозой в PBS. Конъюгат элюируют PBS, содержащим 10 мМ метил-?>-маннозид, и затем снова хроматографируют на колонке с сефакрилом S-200 (42Х95 см) в PBS и собирают фракции, обладающие ферментативной активностью. Конъюгат разбавляют в отношении 1 :2 в 60%-ном глицерине в боратном буфере, добавляют мертиолат и хранят в маленьких порциях.
Другая группа исследователей предложила использовать несколько других реагентов для введения пиридилдисульфидной группы: 3-(4-дитиопиридил)пропионимидат или имидаты с 4,4'-дитиоди-пиридином:
189
NH
t/ SS—^ \i
/
6)
NH
Модифицированный белок с 4-пиридилдисульфидной группой далее реагирует с ферментом, который или содержит, или в него предварительно вводят SH-группу. Удельная активность пероксидазы в конъюгате с IgG, полученным этим способом, сохраняется на 74%.
В связи с развитием методов синтеза конъюгатов белок—фермент с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов возникла необходимость в простых и эффективных способах введения SH-групп в молекулы белков или ферментов. В настоящее время применяют три метода введения SH-групп с помощью: a) SPDP; б) метил-4-меркаптобутиримидата в присутствии 4,4'-дитиодипиридина; в) S-ацетилмеркаптоянтарного ангидрида:
Введение SH-группы в пероксидазу хрена.
К раствору 2 мг пероксидазы хрена в 0,25 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,5, добавляют 1,8 мг S-ацетилмеркапгоянтарного ангидрида (200-кратный избыток) в 10 мкл диметилформамида и перемешивают 30 мии при 30 °С. Затем в реакционную смесь добавляют 50 мкл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 7,0, 6 мкл 0,1 М раствора ЭДТА и 100 мкл 1 М раствора гидроксиламина и инкубируют 5 мин при 30 °С. Полученную модифицированную пероксидазу хроматографируют на колонке (1x45 см) с сефадексом G-25 в 0,1 М фосфатном буфере, pH 6,0, содержащем 4 мМ ЭДТА.
Нековалентные методы. Все описанные методы синтеза конъюгатов белок—фермент основаны на образовании ковалентной связи между молекулами белка и фермента. Но не менее перспективным направлением для получения конъюгатов является путь с использованием высокоспецифических иммунологических связей антиген — антитело или межмолекулярных связей белок—белок.
Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела
в
О (б)— nh2 + СН3С0—s
190
к пероксидазе, PAP). Аналогичный комплекс может быть получен и для щелочной фосфатазы:
(Ат) + IgGE-— © ... IgGn © ... IgCE ... @
Еще один метод, основанный на образовании иммунологической связи, получил название метода «гибридных антител». Смесь F(ab') 2-фрагментов молекул антител против определяемого антигена и фермента обрабатывают меркаптоэтанолом. При этом F(ab')2-фрагменты обратимо диссоциируют на Fab-фрагменты. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, в результате образуются гибридные молекулы антител, специфичные к антигену и ферменту. При добавлении к гибридным молекулам фермента образуется конъюгат антитело—фермент:
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed