Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Гаптены с алифатическими ЫН2-группами могут быть также конъюгированы с е-аминогруппами белков-носителей через гомоби-функциональные реагенты, такие, как глутаровый диальдегид или толуол-2,4-диизоцианат.
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими гидроксильную или карбонильную группу. К гаптенам этого класса относятся различные спирты, фенолы, кетоны, сахара, полисахариды, нуклеозиды, а также такие биологически важные соединения, как стероиды. Обычно эти соединения не используют непосредственно для получения конъюгатов, а превращают их в какие-либо производные, содержащие СООН-группу, которые затем конъюгируют с белками, уже описанными способами.
Соединения, включающие ОН-группу, такие, например, как стероиды, обычно превращают в производные с СООН-группой с помощью реакций:
©-N=N4©
0—nh2 + CICO—fl N02-«^0—NHCO—С N02 -iiil
180
1) этерификации с ангидридами дикарбоновых кислот (например, янтарный ангидрид или малеиновый ангидрид):
/с0\
(ТУ-ОН + R^ ''о -— 0—0—СО—R—СООН
ЧССК
где R = —СН2—СН2— (гемисукцинат) или —СН=СН— (гемималеат)
2) карбоксиметилирования с бром- или иодуксусной кислотой:
0—он + хсн2соон —— (г) о СН2СООН
X = Br, I
3) взаимодействия с фосгеном с образованием хлоркарбонатов:
0—ОН + СОС12-— 0—О—СО—С1
Синтез гемисукцината 11а-оксипрогестерона.
Растворяют в минимальном объеме пиридина 1 la-оксипрогестерон, добавляют 5-кратный избыток янтарного ангидрида и кипятят в колбе с обратным холодильником 20 ч. Раствор выливают в холодную воду и экстрагируют эфиром. После промывки эфирных вытяжек водой продукт экстрагируют раствором гидрокарбоната и осаждают 10%-ным раствором НС1. Вещество переосаждают из СН2С12 гексаном.
Альдегиды и кетоны, а также стероиды, содержащие СО-группу, модифицируют с помощью 0-(карбоксиметил)гидроксиламина (другие названия этого соединения— карбоксиметоксиамин или аминооксиуксусная кислота). В результате реакции получаются так называемые карбоксиметилоксимы, содержащие СООН-группу, по которой проводят пришивку гаптена к белку-носителю:
0—с=0 + nh2—О—СН2СООН -— 0—C=N—о—сн2соон
R R
Синтез 6-О-карбоксиметилоксима 17р-эстрадиола.
Смесь 0,5 г 6-кето-17[}-эстрадиола и 0,5 г 0-(карбоксиметил)гидроксиламин-гидрохлорида растворяют в смеси 60 мл 20%-ного метанола и 40 мл 1 М натрий-ацетат буфера. Инкубируют реакционную смесь в течение ночи при комнатной температуре и упаривают до 20 мл. Доводят pH раствора до 8,5 с помощью 2 н. NaOH и раствор экстрагируют 4 раза по 200 мл этилацетатом. Объединенные органические вытяжки промывают 2 раза по 300 мл 0,1 н. NaOH и 2 раза по 500 мл воды. Собирают все водные вытяжки, подкисляют их раствором НС1 до pH 3,0 н экстрагируют 4 раза по 500 мл этилацетатом. Из этих органических вытяжек отгоняют растворитель и вещество перекристаллизовывают нз ацетона.
В соединении с фенольными ОН-группами, такими, например, как резерпин, Д7-тетрагидроканнабинол, 17р-эстрадиол и др., кар-
181
боксильная группа может вводиться через диазотированную п-ами-нофенилуксусную кислоту:
§ 2. Получение конъюгатов фермент — белок
Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок — фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок — фермент состава 1:1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. В то же время при уменьшении числа молекул фермента, связанных с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецифических взаимодействий конъюгата.
Из реакционной смеси конъюгаты выделяют диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.
В химических методах получения конъюгатов белок-фермент можно выделить две группы по типу сшивающих реагентов — гомо-бифункциональных и гетеробифункциональных. Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется перйодатный метод. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании иммунологической связи антиген-антитело.
Перйодатный метод (метод Накане). Этот метод был впервые предложен японскими исследователями Накане и Каваои (1974) и с тех пор наиболее употребим для получения конъюгатов антител или белков с пероксидазой хрена. Суть метода состоит в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа. Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении перйодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого предварительно или блокированы 1-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы:
182
сн2он
сн2он
(пх)^/\Л-
nh2
