Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
о-карбоксиметилморфина в 15 мл безводного диметилформамида при —5 °С медленно добавляют 196 мкл (1,5 ммоль) изобутилхлорформиата и перемешивают 60 мин. Этот раствор добавляют небольшими порциями к раствору фермента, поддерживая pH 8,8—9,0. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 0 °С и 30 мин при комнатной температуре, затем диализуют 2 дня при 0 °С против буфера, содержащего 4,1 М фосфата натрия и 0,05 М карбоната натрия, pH 9,0.
Карбодиимидный метод. Активацию карбоксильной группы проводят в этом методе с помощью водорастворимых карбодиимидов:
193
гидрохлорида 1-этид-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида или я-толуолсульфоната - 1-циклогексил-3-(2-Й-метилморфолиноэтил) -карбодиимида:
(г)— СООН + RN=C=NR' --? (Т)—CONH—(IT) + HRNCNHR'
(?)—COOCNR'H ? ©~NH2,
NR
О
где RN=C=NR': или CH3CH,N=C=NCH2CH2CH2N(CH3)2 . HCI; /\—N=C=NCH9CH,N^ \
Vv 2 2lW
CH,
so3-f VCH3
Реакцию проводят обычно при pH 5,5—6 в течение нескольких часов. Недостатком метода является побочное протекание внутри-и межмолекулярной сшивки молекул фермента.
Синтез конъюгата эстрадиола с fi-D-галактозидазой.
К раствору 0,5 мг 6-карбоксиметилоксима эстрадиола в 1 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 6,7, охлажденного до 12°, добавляют 1 мг гидрохлорида
1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в твердом виде. Через 30 мин добавляют раствор 20 мг fi-D-галактозидазы в 1 мл того же буфера. После перемешивания в течение 16 ч при 4°С реакционную смесь диализуют в течение ночи при 4 °С в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCI, 0,01 М MgCl2, 0,1% NaN3 и хроматографируют на колонке (2,5X40) см с сефадексом G-25, уравновешенной тем же буфером.
Разновидностью метода является способ с применением N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида в органической среде:
Q^-COOH + C6HnN=NC6Hu
©-
НО—N
COOCNHCH..
II 6 И
NC6H„
/Со—аь
X I
'со—сн2
©-
coo—n:
^со—сн2 \ю—сн.
CONH -о
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. Метод с применением гомобифункциональных сшивающих реагентов. Самый простой способ получения конъюга-
194
тов ферментом с гаптенами, содержащими активные ЫН2-группы, состоит в простом смешении в щелочной среде фермента, гаптена и сшивающего реагента — глутарового альдегида или диметил-адипимйдата:
1. (г)—NH, + 0=СН(СН,)3СН=0 + Nh'2—(Т)—(г)~N=CH(CH2)3CH=N—(Т)
2. 0-NHj * CHjO—С(СН2)4С—OCHj—^0^-NH—С—(СН2)4—С—ОСН3-^=^»-
NH HCI NK HC1 NH HC1 NH-HC1
—- (?у—NH-^—(сн2)4-С—NH—(D
NH-HC! NHHC1
Однако выход конъюгата этим методом невелик и значительно падает его ферментативная активность. Лучшие результаты были получены при проведении реакции в 2 стадии. Сначала обрабатывают гаптен сшивающим реагентом, а затем уже добавляют его к раствору фермента.
Синтез конъюгата щелочной фосфатазы с тироксином.
Суспензию 200 мкг щелочной фосфатазы в 200 мкл буфера центрифугируют и осадок растворяют в 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. Растворяют
2 мг тироксина в 4 мл диметилформамида и 100 мкл этого раствора добавляют к раствору фермента. Затем приливают 10 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают 2,5 ч при 25 °С. Конъюгат очищают хроматографированием на колонке (1ХЮ) см с сефадексом (G-100) в 0,1 М фосфатном буфере.
Метод с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Для получения конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими NH2-группы, в последнее время чаще всего используют гетеробифункциональные сшивающие реагенты, например N-оксисукцинимидный эфир ж-малеимидобензойной кислоты (MBS) и другие:
Этим методом получают конъюгаты в основном с p-D-галакто-зидазой, которая содержит ~ 10 активных SH-групп и не теряет
195
свою ферментативную активность в конъюгате, а также и с другими ферментами, содержащими SH-группы.
Синтез конъюгата бластицидина-S с fi-D-галактозидазой.
Приведем пример ускоренного способа без выделения промежуточных веществ и их очистки. К р'аствору бластицидина — S в 0,02 М фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl и 0,001 М MgCl2, pH 7,0, добавляют в 10 раз меньшее количество N-оксисукцинимидного эфира у-малеимидомасляной кислоты и перемешивают 30 мин при 30 °С. Затем добавляют раствор фермента и еще инкубируют некоторое время. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с сефадексом G-100 в том же буфере и собирают- фракцию, имеющую ферментативную активность.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и другие, имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с ЫН2-группами фермента:
§ 4. Получение конъюгатов антигенов (антител) с субстратами
Конъюгаты антигенов (антител) с субстратами нашли широкое применение в хеми- и биолюминесцентных системах детекции.
• Хемилюминесцентные реакции детекции имеют следующие преимущества: отсутствие фоновых реакций, низкий предел обнаружения, высокое отношение полезного сигнала к фоновому (>50)
196
