Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 69

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 115 >> Следующая

В данном разделе схематично будут рассмотрены методы получения конъюгатов гаптен-носитель для иммунизации.
177
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Наиболее широко распространен метод сме-шанных ангидридов, который состоит в простом эквимолярном смешивании гаптена (Г) и БСА (Б) с изобутилхлорформиатом и основанием (N-метилморфолин, трибутиламин, триэтиламин):
(г)—СООН + С1СОСН2СН(СН3)2—^0-СОО—СОСН2СН(СН3)2—»
где
+ С02 + НОСН2СН(СН3)2
белок
(?)— CONH—(б)
© - гаптен; ©
Этим методом получаются конъюгаты, содержащие 15—30 молекул гаптена.
Синтез конъюгата Ы6-ацетил-Ы'-суксиниленвиомицин—БСА.
Раствор 100 мг (0,11 ммоль) 1Ч6-ацетилвиомицинацетата в 50%-ном диолсане добавляют к раствору 12 мг (0,12 ммоль) янтарного ангидрида в 6 мл диоксана и перемешивают при комнатной температуре. В течение реакции раствор немного подщелачивают 0,1 н NaOH. Через 4 ч диоксан отгоняют в вакууме и смесь хроматографируют на колонке с сефадексом SH-20 (2,5x95 см), используя в качестве элюента дистиллированную воду. Фракции 29—35 (по 10 мл), содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 56 мг 1\’6-ацетил-М'-ге-мисукцинилвиомицина в виде белого аморфного порошка. 50 мг (45 мкмоль) модифицированного гаптена, содержащего СООН-группу, растворяют в 5 мкл диметилсульфоксида, добавляют при —5 °С при перемешивании 5,5 мкл (50 мкмоль) N-метилморфолина и затем 6,6 мкл (50 мкмоль) изобутилхлорфор-миата. Через 10 мин реакционную смесь добавляют к 50 мг (0,75 мкмоль) БСА, растворенного в 10 мл 50%-ного диоксана, и перемешивают 4 ч при 4 °С. Во время реакции поддерживают pH 8,5—9,0, добавляя 0,1 и. NaOH, реакционную смесь хроматографируют на колонке с сефадексом SH-20 (2,5x95) см, уравновешенной дистиллированной водой. Собирают фракции 26—34 (по 10 мл) и лиофилизуют. Получают 43 мг конъюгата 1Ч6-ацетил-М'-сукциниленвиомицин — БСА в виде белого аморфного порошка.
Конъюгаты могут быть получены и с помощью водорастворимых карбодиимидов, таких, как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбо-диимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-М'-метилморфолино-этил) карбодиимид-я-толуолсульфонат:
©—NH2
СООН + RN=C=NR'
©~°
COOCNR'H
NR
(F)—CONH —(e) + HRNCNHR'
где RN=C=NR': или CH3CH2N=C=NCH2CH2CH2N(CH3)2 . HC1;
0~N=c=
NCH,CH,N' О
2 2lW
CH,
so3—к У—CH,
178
Реакция протекает при комнатной температуре, pH 5, за время от 30 мин до 1 дня.
Если гаптен плохо растворяется в водных растворах, то проводят реакцию в водно-органической среде (диметилформамид, диок-сан, тетрагидрофуран).
Синтез конъюгата трийодтиронина — БСА.
К раствору 50 мг БСА в воде добавляют при перемешивании 30 мг водорастворимого карбодиимида и затем 20 мг трийодтиронина в 5 мл диметил-формамида, pH раствора поддерживают при 5,5. Через 30 мин добавляют еще 10 мг водорастворимого карбодиимида и перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Раствор диализуют против 0,01 М фосфатного буфера в течение
1 дня при 4°С. Хранят при —20°С. К молекуле белка пришивается 13 молекул гаптена.
Другой разновидностью этого способа является метод с использованием N-оксисукцинимида. На первой стадии карбоксильная группа гаптена активируется дициклогексилкарбодиимидом в органическом растворителе и взаимодействует с N-оксисукцинимидом с образованием сукцинимидного эфира. На второй стадии активированный эфир реагирует с аминогруппами носителя с образованием пептидной связи:
. (7)— СООН + C6H11N=C=NC6H]1-(г)—СОО—CNHCgH,,
C6H.,N
но—n;
со—сн^
( I
Vo—сн2
(г)— СОО—1
уСО—сн2 \о—Сн
2.
(Т)—СОО—
.со—сн2
\ I
'со—сн,
+ NH2—(б)—*- (г)—СО—NH—(б)
СО—СН,
+ НО—/ |
'со—сн2
Синтез конъюгата простагландина Е2 — БСА.
К раствору 100 мг простагландина ?2 в 1 мл диметилформамида добавляют 60 мг дициклогексилкарбодиимида и 70 мг N-оксисукцинимида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин, отфильтровывают выпавший осадок замещенной мочевины и фильтрат добавляют к раствору 250 мг БСА в 10 мл 0,1М гидрокарбоната натрия. Реакционную смесь инкубируют при 4°С в течение 2 ч, диализуют против 0,05 М фосфатного буфера, pH 8,0, и хранят при —20 °С. С каждой молекулой БСА связывается 15 молекул гаптена.
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими аминогруппу. Гаптены с доступной для модификации аминогруппой можно разделить на две группы по способам их конъюгирова-
179
ния с носителями. К первой группе относятся ароматические амины. Аминогруппа этих соединений превращается в диазониевую соль под действием нитрита натрия и серной кислоты, а затем вступает в реакцию с белками при pH 9:
Реакция протекает по гистидиновому, тирозиновому или трипто-фановому остаткам белка-носителя. Для гаптенов, содержащих ароматические нитрогруппы, например хлорамфеникол, используют этот же метод получения конъюгатов, причем в данном случае нитрогруппу гаптена предварительно восстанавливают до аминогруппы.
Ко второй группе относятся гаптены, содержащие алифатические аминогруппы. Их конъюгаты получают с помощью водорастворимых карбодиимидов. С помощью другого способа такие амины превращают в я-нитробензоиламиды, которые затем восстанавливают до производного, содержащего ароматическую аминогруппу, и конъюгируют с белком через диазониевую соль:
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed