Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• Другой подход основан на использовании материалов в форме шариков, дисков или трубочек, каждый Из которых предназначен для проведения одного анализа. Процедура переноса носителя из пробирки в пробирку, отмывки и т. д. осуществляется с помощью пинцета или вакуумной присоски. Иммобилизация материала может осуществляться адсорбционно или ковалентно. Данный путь позволяет увеличить количество иммобилизованного белка за счет увеличения поверхности, но сохранить при этом методическую простоту операций. Примером подобных носителей могут служить полимерные шарики, нитроцеллюлозные диски, силиконовые трубки, пленки из полимерных материалов и т. д. Кроме этого, антитела (или антигены) могут быть связаны с активированной бумагой или нитроцеллюлозными мембранами, на поверхности которых проводят анализ многих проб.
В выпускаемых коммерческих наборах антитела (или антигены), как правило, находятся в иммобилизованном состояний, и задачей является их правильное использование в соответствии с прилагаемой инструкцией. Но при разработке анализа какого-либо соединения методом твердофазного ИФА с необходимостью иммобилизации сталкиваются все исследователи. Поэтому ниже будут рассмотрены методы иммобилизации антител и антигенов с применением доступных материалов и свойства получаемых препа* ратов.
§ 2. Иммобилизация антител
Ковалентная иммобилизация антител. /Со-валентное связывание антител с носителями осуществляют главным образом за счет свободных амино- и карбоксильных групп, Находящхися на поверхности Глобулы макромолекулы. Для связывания антител могут использоваться многие методы, разработанные для иммобилизации белков и ферментов на носителях органической и неорганической природы. Эти методы различны по степени сложности синтеза и доступности реагентов. Многие из Них могут быть корректно осуществлены только специалистами в области органической и биоорганической химии.
203
Так как в различных лабораториях часто возникает потребность получения иммуносорбентов, остановимся на нескольких простых, малостадийных методиках, для. проведения которых имеются готовые активированные носители или легко доступные полупродукты.
Иммобилизация антител на силохроме, макропористом силикагеле и пористом стекле. Силохромы — неорганические пористые носители на основе кремнезема, выпускаются отечественной промышленностью для целей хроматографии. Различные марки сило-хромов отличаются диаметром пор (35—250 нм) и удельной поверхностью (25—130 м2Д). Для иммобилизации антител чаще всего используют силохром, предварительно модифицированный Y-аминопропилтриэтоксисиланом (у-АПТЭС) и глутаровым альдегидом. Схема реакции:
1) |-он + (C,H50)3Si—(СН2)3—НН2 |- О—S -чсн2)з
__
кремнезем f-АПТЭС v
I -н =СН- сн,- CHZ— с—н о
?) |-N=CH—СНг--СН2 —CHj—С—Н + NHj- (м) —»•
о
—^ |— N=CH—си2—сн2—сн2—CH=N—@
Для увеличения прочности связывания белка с носителем двойная связь может быть восстановлена боргидридом натрия.
Методика.
1. 10 г силохрома кипятят в течение 2 ч в 60 мл безводного толуола в присутствии 2 мл v-аминопропилтриэтоксисилана. Промывают силохром 0,5 л толуола и сушат 5 ч при 50 °С и затем 5 ч при 120°С в вакуумной сушилке при 3990 Па (30 мм рт. ст.). Аминированный силохром может длительное время храниться при комнатной температуре.
2. К 1 г аминированного силохрома добавляют 10 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в холодной дистиллированной воде, инкубируют при медленном перемешивании 4 ч при 4 °С и отмывают носитель от избытка альдегида водой. В процессе активации носитель изменяет цвет с белого на красноватый. Полноту отмывки альдегида контролируют спектрофотометрически при X— = 280 нм. Полученный сорбент может быть использован для иммобилизации немедленно или длительно храниться в высушенном состоянии.
3. К 1 г активированного силохрома в 10 мл 0,01 М К-фосфорного буфера (pH 7,4), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05% тритона X-100, добавляют IgG-фрак-цию антисыворотки или аффинно выделенные антитела. Инкубируют при комнатной температуре и мягком перемешивании. Процесс связывания белка с носителем контролируют спектрофотометрически при А,=280 нм. После прекращения изменения оптической плотности надосадочного раствора (рис. 22) (обычно реакция проходит за 2—3 ч) отмывают носитель 1 М раствором КС1, затем
0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl и хранят в том же буфере при +4°С,
2) |—NH, + Н—С—СН2—СН2—СИ,—С—Н
я ' II II
11
О о
глутаровый альдегид
204
Количество связавшегося с носителем белка определяют по разности начального количества белка и его содержания и промывных водах. В зависимости от удельной поверхности силохрома с 1 г связывается от 20 до 50 мг белка. Для удобства отбора проб гранулы иммуносорбента целесообразно гомогенизировать до образования однородной суспензии, которая легко может дозироваться автоматическими пипетками и лабораторными дозаторами.
Таким же путем может осуществляться иммобилизация антител на макропористых силикагелях и пористых стеклах, также используемых для целей ИФА, механизм активации которых аналогичен рассмотренному.
