Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 71

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 115 >> Следующая

он он
;ОН
—--?- (гойл/4-
PH 4,4
NHj
ОН ОН
NalO,
сн2он
^0Н
г / СН
сн2он
NHj
СН
II
о
СН2ОН
NaBH,
(n^vA/4--* ^
Y.
NH
Для стабилизации основания Шиффа конъюгат иногда обрабатывают боргидридом натрия. Однако наряду с увеличением стабильности конъюгата при обработке NaBH4 ферментативная активность уменьшается приблизительно на 20%.
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG по методу Накане.
К раствору, содержащему 4 мг пероксидазы хрена (^Z-3,0) в 1 мл воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора NaI04 и перемешивают 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор диализуют против 0,001 М натрия ацетатного буфера, pH 4,4, в течение ночи при 4 °С или хроматографируют на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25. К модифицированной пероксидазе хрена добавляют 20 мкл 0,2 М натрий карбонатного буфера pH 9,5, и сразу же 8 мг IgG в 2 мл того же буфера. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH4 (4 мг/мл) и перемешивают 2 ч при 4 “С. Полученный конъюгат или осаждают насыщенным раствором (NH4)2S04 и затем диализуют, или хроматографируют на колонке (1,6X35 см) с сефадексом U-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику. Для стабилизации конъюгата добавляют БСА (1%), мертиолат (0,02%) или глицерин (50%) и хранят в небольших порциях при 4 °С.
Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов. Весьма удобным в качестве сшивающего реагента оказался глутаровый альдегид, который взаимодействует с е-аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде:
183
1. 0—NH2 + 0=CH(CH2)3CH=0
(e)—N=CH (CH2)3CH=0
2. (i)—N=CH (CH2)3CH=0 + nh2—(At)-— (?)— N=CH (CH2)3CH=N—(m)
Были разработаны одностадийный и двухстадийный методы синтеза. В одностадийном методе глутаровый альдегид добавляют к смеси фермента и белка, а в двухстадийном на первой стадии глу-таровым альдегидом обрабатывают только фермент, удаляют избыток альдегида, а затем уже к модифицированному ферменту добавляют белок.
Синтез конъюгатов с применением глутарового альдегида разработан в основном для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и глюкоамилазы. Недостатком метода является невысокий выход конъюгата (1—10%) и поляризация белков, в результате чего теряется иммунологическая активность. К достоинствам метода относится его простота и то, что качество получаемого конъюгата удовлетворяет необходимым требованиям.
Синтез конъюгата тиротропина с щелочной фосфатазой.
100 мкл суспензии щелочной фосфатазы (концентрация ~5 мг/мл) в 2,6 М (NH4)2S04 центрифугируют и осадок фермента растворяют в 150 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. К 100 мкл этого раствора, содержащего 330 мкг фермента, добавляют 100 мкл тиротропина в ,100 мкл фосфатного буфера и 12 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида. После инкубации при 25°С в течение 3 ч реакционную смесь диализуют в течение ночи в 200 мл фосфатного буфера.
Синтез конъюгата IgG с щелочной фосфатазой с помощью глутарового альдегида (одностадийный метод).
К 5 мг щелочной фосфатазы добавляют 0,85 мл раствора IgG (2 мг/мл) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,4, и диализуют в течение ночи при 4 °С против того же буфера для удаления солей аммония. Разбавляют раствор буфером до 1 мл и добавляют 10 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают реакционную смесь 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи при 4°С против того же буфера и затем против 0,01 М трис-буфера, pH 8,0. Полученный раствор конъюгата разбавляют до 4 мл трис-буфером, добавляют БСА до 1% и NaN3 до 0,02%, фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и хранят при 4°С.
Синтез конъюгата IgG с пероксидазой хрена с помощью глутарового альдегида (двухстадийный метод):
Растворяют 10 мг пероксидазы хрена (RZ-3,0) в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 0,15 М NaCl и 1,25%-ного глутарового альдегида, pH 6,8, н перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Удаляют избыток глутарового альдегида диализом против 0,15 М раствора NaCl или хроматографированием на колонке (1x10 см) с сефадексом G-25. Разбавляют до 1 мл 0,15 М NaCl, добавляют I мл раствора IgG (5 мг/мл), содержащего 0,15 М NaCl и 0,1 мл 1 М карбонатного буфера, pH 9,5. Инкубируют 24 ч при 4 °С, затем вносят 0,1 мл 0,2 М раствора лизина для остановки реакции. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,2. Конъюгат осаждают эквивалентным объемом насыщенного раствора (NH4)2SO« и растворяют в 1 мл фосфат-
184
ного буфера. Раствор диализуют или хроматографируют на колонке (1X10 см) с сефадексом G-25 в фосфатном буфере. Раствор центрифугируют при 10 000 g в течение 30 кин, удаляют осадок, добавляют БСА до 1 % и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный конъюгат хранят при —20 °С или при +4°С с добавлением эквивалентного объема глицерина.
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed