Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пе-роксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и p-D-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции я-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда я-бензохиноновое производное белка получают при pH 6, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая:
Конъюгаты получаются с невысоким выходом, гетерогенны и имеют невысокую активность. Метод в настоящее время применяется все реже.
Для получения конъюгатов антител или их фрагментов с [i-D-rа-лактозидазой применяется N, N'-o-фенилендималеимид — гомоби-функциональный сшивающий реагент, содержащий две малеимид-ные группы:
Малеимидные группы быстро реагируют с тиогруппой и медленно с другими функциональными группами белка. Конъюгаты с помощью N, N'-o-фенилендималеимида получают для белков и ферментов, содержащих SH-группы.
Однако дималеимидный метод может быть применен для получения конъюгатов и с другими белками. SH-группы могут быть введены в молекулы белков несколькими методами, в том числе путем частичного восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтила-мином:
185
Синтез конъюгата Fab-фрагмента с р-D-галактозидазой с помощью М, N'-o-фенилендималеимида.
К раствору 1,6 мг (3,0 нмоль) fi-D-галактозидазы в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,0, добавляют 6 мкл (1200 нмоль) 0,2 М (53,6 г/л) N, N'-o-феиилендималеимида в диметилформамиде и перемешивают 20 мин при 30 °С. Реакционную смесь хроматографируют на колонке (1x45) см с сефадексом G-25 в фосфатном буфере, содержащем 1 г/л БСА с SH-группами, блокированными N-этилмалеимидом. К модифицированному ферменту добавляют 1,4 мг (15 нмоль) Fab в фосфатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТа, и инкубируют 20 ч при 4°С. Добавляют 1/100 объема раствора NaN3 (100 г/л) и 1 нМ 2-меркаптоэта-нола для блокирования свободных малеимидных групп. Хроматографируют на колонке (1,5X45 см) с сефарозой 6 В в 0,01 М фосфатном буфере pH 6,5, содержащем 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 г/л NaN3 и 1 г/л БСА.
Иногда используют N, N'-оксидиметилендималеимид для получения конъюгатов дималеимидным методом, но этот реагент не имеет особых преимуществ перед N, N'-o-фенилендималеимидом и, кроме того, он менее доступен. Дималеимидный метод может проводиться при pH не выше 6,0—6,5, так как малеимидные группы нестабильны при высоких pH.
О Конъюгаты, полученные этим методом, практически не теряют ферментативную активность, дают низкое неспецифическое связывание и не образуют полимерных частиц.
Получение конъюгатов с помощью гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Первым из гетеробифункциональных сшивающих реагентов для получения конъюгатов был применен N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты (MBS). В 1976 г. с помощью этого реагента впервые был описан синтез конъюгата инсулина с p-D-галактозидазой. Метод заключается во введении малеимидных групп в молекулу белка при взаимодействии N-оксисукцинимидной группы сшивающего реагента с NH2-группой белка с образованием пептидной связи, которые затем уже реагируют с SH-группами фермента:
186
р
о.
(б>—nh2 +
(S)—NHCO—^
Конъюгаты по этому методу получаются с высоким выходом, без образования каких-либо еще полимерных продуктов и имеют обычно состав 1 : 1. Ферментативная активность в конъюгате полностью сохраняется.
Синтез конъюгата дигоксин — уреаза с помощью MBS.
К 0,4 мл раствора IgG (10 г/л) в 0,05 М фосфатом буфере, pH 7,5, содержащем 0,1 мМ NaCt (PBS) добавляют 100 мкл 8 мМ раствора MBS в диметил-формамиде, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и хроматографируют на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25, уравновешенной PBS. К 3 мл раствора, содержащего модифицированный IgG, добавляют 13 мг уреазы и перемешивают 30 мин. Полученный конъюгат диализуют в течение нечи против PBS и хранят при —20 °С с добавлением 50% глицерина.
Другим широко используемым гетеробифункциональным сшивающим реагентом является N-оксисукцинимидный эфир (4-карбокси-циклогексилметил)малеимид, который более стабилен, чем MBS.
Синтез конъюгатов этим методом проводят при pH 7. При более низких pH реагенты малореакционноспособны, а при более высоких pH конъюгаты менее устойчивы.
Малеимидные соединения, применяемые для получения конъюгатов, недостаточно хорошо растворимы в водных растворах и иногда выпадают в осадок во время проведения реакций. Для определения наиболее реакционноспособных, растворимых и стабильных сшивающих реагентов были проанализированы различные Н-оксисукцинимидные и N-сульфосукцинимидные эфиры малеимид-ных соединений. Было показано, что конъюгаты Fab-фрагментов с пероксидазой хрена лучше всего получаются с использованием N-оксисукцинимидных эфиров 3-малеимидопропионовой или 5-ма-леимидомасляной кислоты:
187
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится и N-оксисукцинимидный эфир 4-йодацетил аминобензойной кислоты (SIAB). Этот реагент аналогичен по действию MBS и основан на способности йодопроизводных реагировать с SH-группой с образованием тиоэфиров:
