Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Методика.
В лунки планшетов для ИФА из поливинилхлорида вносят по 100 мкл раствора 2%-ного глутарового альдегида в К-фосфатном буфере, pH 5,0. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре и трижды промывают луики 0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl, pH 7,0. Затем вносят в лунки по 100 мкл IgG-фракции антисыворотки к HBs-антигент в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М Na-карбонатом буфере, pH 9,5, и инкубируют в течение ночи при 4 °С. После 3-кратной промывки фосфатным буфером с 0,1, М NaCl, pH 7,0, планшеты готовы для применения в ИФА.
Другим доступным реагентом для активации полистирола и полипропилена является толуол-2,4-диизоцианат (ТЦ). При использовании для иммобилизации на полистирольных пробирках высоких концентраций IgG (1 мг/мл) в случае активации ТЦ связывается белка в 2,7 раза больше,.чем при активации глутаровым альдегидом, и в 1,7 раза больше, чем при простой адсорбции. Однако при концентрациях IgG 0,1 и 0,01 мг/мл количество белка, связавшегося через глутаровый альдегид, в 1,3 раза выше, чем через ТЦ. Аналогичные закономерности сохраняются при связывании IgG с полипропиленом.
Предположительно эффект связывания ТЦ с твердой фазой основан на присоединении (сорбции?) реагента на поверхности полистирола, модифицированной органическим растворителем. Затем изоцианатная группа реагента взаимодействует с аминогруппами лизина IgG, образуя ковалентную связь.
207
Методика.
В полистирольные (или полипропиленовые) пробирки добавляют 0,5 мл 0,5%-иого ТЦ, растворенного в четыреххлористом углероде, и быстро отсасывают раствор (чтобы не допустить существенного растворения полимера). Оставляют пробирки на 3 ч при комнатной температуре для высушивания остатков растворителя. Вносят в пробирки IgG в 0,5 мл 0,01 М М-а-фосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 0,14 М NaCl и 0,1% NaN3. Инкубируют 20 ч, отсасывают раствор и добавляют в пробирки 0,6 мл 1%-ного БСА в том же буфере для блокировки активных групп ТЦ. Инкубируют 2 ч и трижды промывают пробирки фосфатным буфером.
Рис. 23. Изотерма адсорбции меченных пероксидазой антител в лунках полисти-рольиого планшета для ИФА, pH 7,4 (а); и кинетика адсорбции конъюгата АТ—ПХ (21 пмоль) в лунке полистирольного планшета для ИФА; pH 7,4 (б):
а — по оси абсцисс — начальное количество меченных пероксидазой аитетел (АТ—ПХ); по осн ординат — количество антител, связавшихся с твердой фазой; б — по оси абсцисс — время, мин
Последний из применяемых подходов основан на предварительной сорбции на пластике поли-?-лизина, который адсорбируется на поверхности практически необратимо. Далее с помощью глутарового альдегида (или другого агента) с полимером могут быть связаны антитела, антигены, целые бактериальные клетки. Процедура сорбции поли-?-лизина включает добавление его в лунки планшета для ИФА в концентрации 0,1 мг/мл в 0,15 М фосфатном буфере (pH 7,4), инкубацию в течение 30—60 мин и промывку лунок буфером.
Подходы, основанные на комбинации методов адсорбции и ковалентного связывания, все шире используются в ИФА, обеспечивая улучшение воспроизводимости результатов анализа.
Адсорбционная иммобилизация антител. Этот метод наиболее распространен в ИФА, что обусловлено, в основном, крайней простотой процедуры иммобилизации, не требующей применения каких-либо активирующих агентов.
При добавлении раствора антител в лунки планшетов или пробирки из полимерных материалов часть молекул адсорбируется на поверхности носителя за счет ионных и гидрофобных взаимодей-
208
стйий, а также образования водородных связей. Количество сорбированного белка определяется природой полимера, площадью поверхности, временем контакта, концентрацией белка, pH и ионной силой буфера, температурой. На рис. 23 приведены зависимости количества связанного на носителе конъюгата от его содержания в растворе и времени инкубации. Насыщение центров сорбции полистирола достигается при концентрации белка, равной 2—
5 мкг/мл. При этом с поверхностью лунки (5«1,6 см2) связывается около 60 нг белка. Длительность процесса адсорбции при 4°С и pH 7,4 составляет около двух часов, но 60% сорбированного белка связывается за первые 30 мин.
Полной корреляции данных по сорбционным свойствам полистирола в литературе не наблюдается. В известной степени это может быть объяснено тем, что в экспериментальных работах применяли носители разных фирм, которые могут отличаться составом и сорбционными свойствами полимера. Другая причина может заключаться в том, что в разных опытах использовались IgG различных животных, которые отличаются по свойствам. Так, при исследовании адсорбции IgG быка на полистирольных.пробирках показано, что на площади 6,5 см2 связывается около 1,8 мкг белка (или 280 нг/см2). На полистирольных пробирках (LKB, Швеция) сорбируется ~ 100 нг IgG человека на 1 см2.
• Как отмечалось ранее, адсорбционная связь белка с поверхностью менее прочна, чем ковалентная, что является одним из основных недостатков данного способа иммобилизации. Например, при сравнительном изучении десорбции БСА с активированной бромцианом бумаги и полистирольных кювет (фирмы Labsystems, Финляндия) показано, что в случае ковалентной пришивки и адсорбции в процессе анализа с подложки смывается 13 и 37% белка соответственно.
