Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
условии, что все L групп одинаково
реакционноспособны) доля оставшихся немодифицированными необходимых для
активности групп (/е) будет равна доле всех немодифицированных групп
данного вида (/) и активными будут только те молекулы, у которых интактны
все важные для активности группы. Следовательно,
а~1еп, или а>!п=1е, (8.138)
и
а>>п = 1. (8.139)
Таким образом, если построить график зависимости Iga от lg /, то наклон
полученной прямой будет указывать число групп, необходимых для активности
фермента (п). Можно также построить графики зависимости а, Уа, и т.
д. от I и, выбрав тот
из них, который наиболее близок к прямой, определить тем самым п.
Этот метод применим и в тех случаях, когда скорости модификации
реакционноспособных групп значительно различаются. Пусть, например,
имеется I реакционноспособных групп, которые можно разделить на три типа:
тип h, группы которого реагируют с модификатором со значительно большей
скоростью, чем группы всех других типов, и не являются необходимыми для
активности, тип /, группы которого реагируют значительно медленнее,
причем п групп этого типа необходимы для активности, и тип I-h-/, группы
которого реагируют с модификатором медленнее или не реагируют вообще и не
являются необходимыми для активности. После модификации определенной
части групп, необходимых для активности, соотношение между суммарной
долей оставшихся немодифицированными групп (/) и долей оставшихся
немодифицированными групп, необходимых для активности (1е), будет
определяться выражением
Y=jle + (l-j--h) ^ (8140)
После подстановки а1,п вместо 1е и соответствующего преобразования
получим
д1 m=lT-(l-i-hK (8.141)
Следовательно, график зависимости а1/п от I будет представлять
Ингибирование и активация ферментов
541
Рис. 8.20. А. Соотношение между долей исходной активности (а) и долей не-
модифицированных групп (/) для системы модификатор-фермент, описываемой
уравнением (8.141). Б. Соотношение между долей исходной активности и
числом модифицированных групп на молекулу фермента (V) для системы,
описываемой уравнением (8.143). I - график зависимости а от V, II -
график
3-
зависимости \а от Г, из которого видно, что имеются три существенные
группы, которые подвергаются модификации [4801].
собой прямую с наклоном /// и с l=(l-h)/l при а1/п=1 и /= 1 при а1/п =
(j+h)/j. Это позволяет найти / и h, если известно I (см рис. 8.20,А).
Если же суммарное число реакционноспособных групп (/) в молекуле
неизвестно, то определить долю немо-дифицированных групп (I) нельзя,
однако можно найти число модифицированных групп в молекуле (/').
Поскольку
7=-Ц^, (8.142)
то, подставляя это выражение в (8.141) и сделав соответствующие
преобразования, получим
fli/"= i + h~1' . (8.143)
Следовательно, график зависимости а1/п от V будет представлять собой
прямую с наклоном - 1//; величину h можно найти, зная длину отсекаемого
от соответствующей оси отрезка. В обоих рассмотренных выше случаях п
можно определить путем построения графиков зависимости а, Уа, fа и т. д.
от Г (или I) до тех пор, пока не получится прямая, как показано на рис.
8.20, Б.
542
Глава 8
Тсоу вывел уравнения для ряда других механизмов, при которых модификация
групп фермента приводит к потере активности. Его метод является более
сложным, чем метод Рея и Кошланда, однако он может оказаться полезен в
тех случаях, когда модификация осуществляется слишком быстро и поэтому
трудно определить скорость процесса. Метод может быть применен также для
анализа систем, в которых проследить динамику процесса модификации во
времени удается, но ингибитор не может быть взят в избытке и тем самым
процесс модификации не может считаться реакцией псевдопервого порядка.
Хотя использование рассмотренных выше методов для определения остатков,
которые необходимы для активности, нашло широкое применение, получаемые
результаты не всегда оказываются однозначными. В ряде случаев бывает
недостаточно определить общее число модифицированных остатков на
молекулу, поскольку модификация одного из двух остатков, находящихся в
непосредственной близости друг от друга в структуре нативного белка,
может исключить возможность модификации другого. Именно такая ситуация
наблюдается при модификации остатков гистидина в панкреатической
рибонуклеазе (КФ. 3.1.27.5) [916]. При обработке рибонуклеазы иодацетатом
(pH 5,5) происходит карбоксиметилирование в молекуле фермента только
одного остатка гистидина, при этом наблюдается полная потеря активности.
Однако оказалось, что представление, согласно которому модификации
подвергается только один остаток гистидина, ошибочно, поскольку, как
показал анализ продуктов, модификации подвергаются два остатка гистидина
- 12 и 119, причем модификация любого из этих остатков вызывает
инактивацию фермента. То обстоятельство, что не удается получить препарат
фермента, в котором модифицированы оба остатка гистидина, согласуется с
общей стехиометрией реакции и показывает, что модификация одного из
