Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
входящие в уравнение константы Михаэлиса можно определить так, как это
описано в гл. 4.
548
Глава 8
Рис. 8.22. Графики двойных обратных величин для системы, описываемой
уравнением (8.147); /С,А=10, КыА==Kss = 1. Концентрация второго реактанта
указана на кривых.
Если константа ДмА очень велика, то А будет функционировать как
бесконкурентный ингибитор (с. 493-497). При промежуточных значениях АмА и
KiA на скорость влияют обе эти константы. Примеры графиков двойных
обратных величин для таких систем приведены на рис. 8.22 (при А'МЛ = 0,1
KiA).
Механизм процесса в случае неупорядоченного связывания активатора и
субстрата может быть представлен в виде следующей схемы:
|-<-t:EA^=fc| |ч->-ЕА^=>|
Е EAS чр=* ЕАР Е. (8.150)
|±=?ES:fc=>:| |^=>:ЕР="==5=|
Кинетический анализ такого механизма сходен с тем, который используется
для неупорядоченных двухсубстратных систем (с. 134-135). Если распад
тройного комплекса в прямом направлении происходит достаточно медленно и,
следовательно, стадии связывания субстрата и активатора находятся в
равновесии, то уравнение скорости будет иметь вид
^ /Г(r) А/Г(r) КА 1
'уЛм Ам 'Ч Ам
s "г а ' as "f" s a as
где Kss и KSA - константы диссоциации S и А из соответствующих двойных
комплексов, a Ams и Ама - константы их диссоциации из тройных комплексов.
Константы, входящие в уравнение (8.151), можно определить, построив
первичные и вторичные графики (см. гл. 4). Если константы диссоциации
тройных комплексов отличны от констант диссоциации двойных комплексов, то
при изменении концентрации А будет изменяться как
Ингибирование и активация ферментов
549
наклон графиков двойных обратных величин, так и длина отсекаемых ими
отрезков; в таком случае активацию можно назвать смешанной по аналогии со
смешанным ингибированием (с.
491-493). Когда связывание субстрата не влияет на связывание активатора
(и наоборот) (Asa = Kma и Kss = Kms), уравнение (8.151) принимает вид
и активацию называют "неконкурентной", поскольку при повышении
концентрации активатора v увеличивается, a Kss не изменяется (см. с.
487).
Как уже отмечалось выше, в случае двухсубстратных реакций и реакций
ингибирования, описываемых уравнением вида (8.150), анализ в стационарном
приближении приводит к кинетическим уравнениям, которые в общем случае
слишком сложны, чтобы их можно было использовать на практике (см-c. 490-
491 и гл. 4,с. 135-137).
Нередко активатор проявляет свое действие в результате связывания не с
ферментом, а с субстратом, например АТР находится в клетке
преимущественно в виде комплекса с ионами Mg2+ и было показано, что
комплекс MgATP является субстратом многих ферментов [832], в том числе
гексокиназы (КФ 2.7.1.1) '[3765], пируваткарбоксилазы (КФ 6.4.1.1) и
карбамоил-фосфатсинтазы (аммиак) (КФ 2.7.2.5) [1235]. Уравнения
односубстратной реакции, для которой истинным субстратом является
комплекс активатор - субстрат, могут быть записаны в следующем виде:
Если допустить, что реакция (8.153) протекает достаточно быстро и,
следовательно, является равновесной при всех условиях, то концентрация
истинного субстрата (as) будет равна
где а и s - концентрация свободных активатора и субстрата, Ка - константа
диссоциации комплекса AS. Следовательно, кинетическое уравнение для
простой односубстратной реакции. (8.154) как в равновесных, так и в
стационарных условиях должно быть преобразовано к виду
V
(8.152)
A + S AS,
(8.153)
(8.154)
E-f-AS 7-* EAS ---------> Е + АР.
(8.155)
V
(8.156)
v
isAS is Am A a
1 "b n7T~
a-s
.550
Глава 8
Это приводит к довольно неожиданному результату, ибо показывает, что
максимальная скорость, достигаемая при увеличении а или s, оказывается
одной и той же при условии, что s или а соответственно сохраняются
постоянными. Следовательно, создается впечатление, что фермент может быть
насыщен •субстратом даже при низкой концентрации субстрата, если повысить
концентрацию активатора. В действительности, однако, это не так. Дело в
том, что в приведенные выше уравнения входят концентрации свободных
активатора и субстрата, и, для того чтобы при увеличении концентрации
активатора поддерживать постоянной концентрацию свободного субстрата (s),
необходимо значительно увеличить общую концентрацию субстрата, а это
равнозначно насыщению фермента его истинным субстратом путем увеличения
концентрации комплекса активатор-субстрат. Важность расчета концентраций
свободных активатора и •субстрата для анализа таких систем подчеркивают
Рабин и Крук [3778]!, а также другие авторы, однако во многих работах все
еще оперируют общими концентрациями активатора и •субстрата.
Из графика зависимости обратной скорости от обратной концентрации либо
свободного субстрата, либо свободного активатора можно определить V и
сложную константу Михаэлиса. Константы Михаэлиса при изменяющихся s и о
равны соответственно
v-ASr/-
Ам Да
Ам.каж- " ,
(8.157)
к _ *М *а
^а.каж s
Определить либо Kmas, либо Ка по отдельности не представляется возможным.
