Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
уравнениям (8.126) и (8.129) [2480]. Ингибирование
ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) (3-гидроксифенил) триметилам-
монийиодид-метансульфонатом в присутствии (1) и в отсутствие (//)
конкурентного ингибитора - тетраметиламмонийиодида
I I I I I I | . |_I-1-I-I-I-ill 1- t
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
1/ixlO3
(2,4 мМ).
то из графика зависимости 1/&,1абл от 1/i можно будет определить k+2 и
Ki- Пример такого графика приведен на рис. 8.15. Следует отметить, что в
том случае, когда процесс ингибирования протекает без образования
нековалентного комплекса, а в соответствии с уравнением (8.106),
константа скорости реакции псевдопервого порядка будет линейно возрастать
с увеличением концентрации ингибитора.
Если в системе имеется субстрат или конкурентный ингибитор, который
препятствует связыванию необратимого ингибитора, то система может быть
представлена следующей схемой:
Это уравнение можно сопоставить с уравнением (8.119), описывающим
систему, в которой конкурентный ингибитор также защищает фермент, однако
отсутствует стадия образования нековалентного комплекса ингибитора с
ферментом. Из уравнения
Е 3=":
(8.127)
ES
В этом случае
(8.128)
или в обратной форме
(8.129)
Ингибирование и активация ферментов
535
(8.129) следует, что график зависимости 1/6набл от 1/t имеет наклон
Ki{l-\-s/Ks)/k+2 и отсекает от оси 1/6набл отрезок длиной 1/6+2 (рис.
8.15). Если построить ряд таких графиков при нескольких фиксированных
концентрациях s, а затем построить вторичный график зависимости наклонов
первичного графика от s, то наклон этого вторичного графика будет равен
Кг/к+гКя, а длины отрезков, отсекаемых от оси наклонов и оси s, будут
равны Ki/k+2 и -Ks соответственно; в результате могут быть определены все
три константы, входящие в уравнение (8.129).
Используя соединения, которые необратимо реагируют с остатками
определенных аминокислот в ферменте, можно получить информацию о природе
тех остатков, которые участвуют в каталитическом процессе. Известно
большое число соединений, специфически реагирующих с боковыми группами
определенных аминокислотных остатков в белках; подробный перечень таких
соединений приведен в работах [814, 3094, 4465]. К сожалению, лишь
немногие из этих реагентов являются абсолютно специфичными по отношению к
одному типу боковых групп аминокислот, а те, которые обладают такой
специфичностью, обычно реагируют с боковыми группами нескольких
одноименных аминокислот. Следовательно, нужен метод, позволяющий
устанавливать корреляцию между утратой ферментативной активности и
степенью модификации боковых групп индивидуальных аминокислот в ферменте.
Кинетический метод анализа данных такого рода предложили Рей и Кошланд
|[3841]. Фермент инкубируют с избытком ингибитора, так что модификация
протекает как реакция псевдопервого порядка; через заданные интервалы
времени определяют остаточную активность и степень модификации всех
атакуемых остатков. Очевидно, что в том случае, когда модифицируется
только одна аминокислота и ее модификация приводит к потере активности,
изменение активности описывается уравнением типа (8.111). Если для
активности важны два остатка (X и Y) и они модифицируются реагентом с
разной скоростью (обозначим константы скорости соответствующих процессов
через 6+i и 6+2), то систему можно представить в следующем виде:
X*
/
Е
/Х \ Х*
е < (8.130)
Y s Y*
/Х /ktl
Е /
\
Y*
(звездочками обозначены модифицированные остатки). По-
536
Глава 8
скольку потеря активности происходит при модификации любого из остатков,
можно записать
где А и Л0 - активности фермента в момент времени t и t0, а kA- константа
скорости псевдопервого порядка процесса потери активности. Это выражение
можно записать также в виде
Следовательно, константа скорости псевдопервого порядка процесса потери
активности равна сумме констант скоростей реакции модификации важных для
активности остатков. Для фермента, содержащего п таких остатков,
реагирующих с ингибитором, уравнение (8.131) переходит в
Примеры системы, в которой имеются четыре остатка, реагирующих с разными
скоростями, рассмотрены на рис. 8.16; видно, что сумма констант скоростей
первого порядка для реакции двух из этих остатков (k-н и k+2) равна
константе скорости процесса потери активности (kA); это свидетельствует о
том, что модификация любого из этих остатков приводит к потере
активности. Хотя константа скорости модификации третьего остатка (k+г)
меньше kA и в рассматриваемом гипотетическом случае k+\-\-k+2 = kA,
неизбежные ошибки эксперимента при определении констант скорости не
позволяют исключить возможности, что модификация третьего остатка также
приводит к потере активности. В то же время, поскольку четвертый остаток
модифицируется со скоростью й-м, превышающей скорость потери ферментом
активности, можно заключить, что модификация этого остатка не может
прямым путем вызывать потери активности. Следует отметить, что
рассматриваемый метод позволяет также определить, сколько остатков
