Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
продолжительности инкубации фермента и ингибитора (до начала определения
активности фермента) и в тех случаях, когда субстрат защищает фермент от
ингибирования, от концентрации субстрата; в то же время истинная
константа Ki не зависит от всех этих параметров. Следовательно, прежде
чем пытаться определять Ki, необходимо доказать, что ингибитор обратимо
взаимодействует с ферментом. Наиболее простой путь - это показать, что
ингибирование можно обратить путем диализа или гель-фильтрации. Можно
также исследовать, происходит ли восстановление активности при
разведении, поскольку только при обратимом ингибировании раз-ведение
смеси будет вызывать некоторую диссоциацию комплекса фермент-ингибитор.
Признаком необратимости ингибирования нередко является увеличение во
времени степени ингибирования, однако этот признак не может
рассматриваться как однозначное доказательство данного механизма.
Например, нелинейный график хода реакции может быть обусловлен тем, что
при связывании ингибитора с продуктом реакции образуется обратимый
ингибитор [4749]. Увеличение во времени степени ингибирования может
наблюдаться также в том случае, когда добавленное к системе соединение
само не ящ1яется эффективным ингибитором, однако превращается в обратимый
ингибитор под действием фермента '[4749].
Если необратимый ингибитор взаимодействует с какой-то группой активного
центра, то присутствие субстрата или конкурентного ингибитора будет
защищать фермент от ингибирования, замедляя этот процесс. По
эффективности защитного действия можно определить константу диссоциации
комплекса фермента с "защищающим" соединением [3157]. Рассмотрим систему
Е + А ^=fc ЕА,
(8.112)
k
Е+ I ----> Е-I,
где А - либо субстрат, либо конкурентный ингибитор фермен* та; по условию
необратимый ингибитор может связываться только со свободным ферментом.
Можно записать, что
e=ef-\-x-\-z, х=-^~, (8.113)
где е и е/ - полная концентрация фермента и концентрация свободного
фермента соответственно, х - концентрация коми-
532
Глава 8
лекса ЕА, г - концентрация необратимо ингибированного фермента (Е-I).
Решая уравнение (8.113) относительно е/, получаем
^=-тйНг- (8'"4>
Поскольку необратимый ингибитор соединяется только со свободным
ферментом, то
dec
-=kefi =k'ef, (8.115)
где i - концентрация необратимого ингибитора; предполагает-
ся, что реакция протекает в соответствии с кинетикой псевдопервого
порядка.
В отсутствие А (8.115) можно записать в виде
-^f=k'(e-z), (8.116)
а при наличии А, подставляя (8.114) в (8.115), находим
dfif ъ'К
~ТГ=т??г <"-*>¦ <8-"7>
Уравнение (8.117) можно записать в виде
1г=А'каж(е-z). (8-118)
"• каж '
где А/каж -- кажущаяся константа скорости реакции псевдопервого порядка,
которую можно определить по графику зависимости In (е-z) от времени.
Поскольку
ТГ-=Т-+ППГ- 'в'119*
я каж к
то график зависимости 1/&'каж от а будет иметь наклон l/Ksk' и отсекать
от оси lfk'Ka>K отрезок длиной 1/k', а от оси а - отрезок длиной -As.
Рис. 8.14 иллюстрирует применение этого метода на практике. Милдван и
Лейг [3157], использовали необратимый ингибитор, л-хлормеркурибензоат,
для определения константы диссоциации комплекса пируваткиназы (КФ
2.7.1.40) с Мп2+.
Реакцию связывания необратимого ингибитора с ферментом можно
рассматривать как процесс, на первом этапе которого образуется
нековалентный комплекс (EI), а на втором происходит ковалентное
связывание фермента с ингибитором:
&+1 *+2
Е + 1ч=ЬЕ1 > E-I. (8.120)
ft-i
В ряде случаев удается исследовать каждую из стадий по отдельности [250,
2480]. Стадию обратимого взаимодействия фер-
Ингибирование и активация ферментов
533
Рис. 8.14. Определение константы диссоциации комплекса пируват-киназы с
Мп2+ [3157]. Приведена зависимость величины, обратной константе скорости
псевдопервого порядка (%'каж), от концентрации Мп2+ для необратимого
ингибирования фермента л-хлормеркури-бензоатом.
[Мп]" W4, М
мента и ингибитора можно изучать, определяя влияние, которое оказывает
изменение концентрации ингибитора на скорость необратимого ингибирования.
Скорость второй стадии (необратимое ингибирование) зависит от
концентрации нековалентного комплекса EI (у):
-5г=М. (8Л21)
где у и z - концентрации комплексов EI и Е-I соответственно. В том
случае, когда превращение EI в Е-I происходит относительно медленно по
сравнению с распадом EI на свободный фермент и ингибитор первая стадия
реакции будет
находиться в равновесии, поэтому можно записать
к - (е~У)1
Aj -
У
и, следовательно,
У-
1 +Kt/i '
Подставляя (8.123) в (8.121), находим
dz k+2e ~дГ~ 1 +KiH
и после интегрирования получаем
йнабл^ = 1п(е -2),
где
ь , - ___
набл i + Кф •
Следовательно, зависимость наблюдаемой константы скорости первого порядка
(&набл) от i будет иметь гиперболический характер. Если (8.125 а)
представить в обратной форме
1 _ 1 | Kt 1
i *
(8.122)
(8.123)
(8.124)
(8.125) (8.125 а)
&набл
*+2
(8.126)
534
Глава 8
Рис. 8.15. График зависимости 1/йнабл от 1/i для системы, подчиняющейся
