Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1. Растворите осадок, полученный на стадии 7 табл. 3, в 20 мкл буфера для метилазы ZicoRI1).
2. Добавьте 2 мкл 100 мкМ раствора Б-аденозил-Ь-метионина2*, 0,2 мкл раствора метилазы ?coRl (1,8 мг/мл) или количество фермента, достаточное для метилирования 1 мкг ДНК. Конечный объем реакционной смеси 22 мкл.
3. Проинкубируйте 15 мин при 37°С, затем 10 мин при 70 °С.
¦) Буфер для метилазы EcoRi содержит 50 мМ трис-НС1 pH 7,5- 1 мМ Naa3flTA 5 мМ ДТТ.
2) Раствор Б-адеиознл-Ь-метнонина приготовьте по методике, приведенной в разд. 2.2.
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
87
А Б В Г
г
1831 -
511 -344-
220-
:¦ I
Рис. 4. Фракционирование кДНК по размеру. Аликвоты меченной 32Р кДНК разделяли электрофорезом в 1,2%-ном агарозном геле в щелочном буфере. Гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой. А — стандарты длины (указано число нуклеотидов); Б — продукт синтеза первой цепи; В — продукт синтеза второй цепи; Г — кДНК после обработки нуклеазой S1.
После обработки нуклеазой SI распределение продукта по размеру должно стать таким, как продукта реакции синтеза первой цепи.
2.5.4. Метилирование кДНК с помощью ?coRI
Метилирование предохраняет кДНК от расщепления рестриктазой ?соШ при образовании липких концов с помощью синтетических линкеров (см. разд. 2.5.8). Методика метилирования приведена в табл. 4.
2.5.5. Достройка концов ДНК-полимеразой I
В ходе этой реакции увеличивается число тупых концов ДНК, к которым при помощи ДНК-лигазы Т4 можно присоединять химически синтезированные линкеры. Процедура описана в табл. 5.
88
Глава 2
Таблица 5. Реакция достройки концов ДНК-полимеразой I
1. В пробирку, содержащую 22 мкл метилированной кДНК (стадия 3,. табл. 4), внесите 2,5 мкл 0,1 М MgCb; 2,5 мкл 0,2 мМ d^ACGTjTP1*;
0,25 мкл (5 единиц)2) гомогенной ДНК-полимеразы I (1 мг/мл). Конечный» объем реакционной смеси 27 мкл.
2. Проинкубируйте 10 мин при комнатной температуре и добавьте 10 мкл 50 мМ №3ЭДТА.
3. Добавьте в качестве носителя 1 мкг нерасщепленной ДНК Х-вектора (XgtlO или A,gtll). Экстрагируйте равным объемом смеси фенол: хлороформ (1 : 1), насыщенной ТЕ pH 7,53>. Отцентрифугируйте 3 мин при комнатной температуре в микроцентрифуге.
4. Перенесите водную фазу в другую микроцентрифужную пробирку в-экстрагируйте органическую фазу еще дважды 25 мкл ТЕ pH 7,5. Объедините водные фазы и экстрагируйте их трижды равным объемом эфира, насыщенного ТЕ pH 7,5.
5. После удаления эфирной фазы удалите остатки эфира, инкубируя смесь в течение нескольких минут при 37 °С. Внесите ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М. Добавьте два объема этанола и осадите ДНЩ на спиртовой бане с сухим льдом в течение 30 мин.
6. Соберите осадок ДНК в микроцентрифуге (15 мин при 4°С). Удалите-надосадок и промойте осадок один раз охлажденным до —20°С 70%-ным' этанолом. Отцентрифугируйте еще раз.
7. Осторожно удалите этанол и высушите осадок на воздухе.
¦) См. примечание 3 к табл. 1. 2) См. примечание 2 к табл. 2. s) См. примечание 4 к табл. 3.
2.5.6. Мечение fcoRI-линкеров по 5'-концам
Методика введения метки в линкеры приведена в табл. б. Убедиться в том, что киназная реакция прошла, можно, если лигировать линкеры и проанализировать продукты при помощи гель-электрофореза и радиоавтографии.
1. Смешайте 1 мкл 32Р-меченых линкеров (100 нг) с 4 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДДТ; 1 мМ АТР.
2. Добавьте 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4 (1,6 мг/мл) и проинкубируйте в течение 6—24 ч при 12—14 °С.
Таблица 6. Мечение Есо RI-линкеров по 5'-концам
1. Смешайте в указанном порядке: дистиллированную воду (34 мкл ми*
нут объем киназы) 5 мкл десятикратного буфера для киназы1), 10 мкл раствора линкеров jE'coRI2), 1 мкл АТР и 30 единиц3) полинуклеотидки-
назы Т4. Конечный объем 50 мкл.
2. Проинкубируйте 1 ч при 37 °С.
3. Храните при —70 °С. Перед использованием линкеров проверьте их: способность к лигированию друг с другом (см. разд. 2.5.6).
') Десятикратный буфер для кииазы содержит 0,5 М трис-НС1 pH 7,5; 0,1 М МеС12‘ 0,1 М ДТТ; 10 мМ АТР.
2) Линкеры растворяют в ТЕ в концентрации 500 мкг/мл.
s) 1 единица киназы катализирует перенос 1 наномоля фосфата на 5'-ОН конец полинуклеотида с [у-мР] АТР за 30 мни при 37 °С.
Конструирование библиотек в векторах XgtlO и A,gtll
89
Таблица 7. Присоединение Есо RI-линкеров к двухцепочечной кДНК
1. Растворите осадок (стадия 7, табл. 5) в 4,5 мкл раствора меченых ?соЩ-линкеров (100 мкг/мл), полученных на стадии 3 табл. 6.
2. Добавьте 0,5 мкл 10 мМ АТР; 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4'> (1,6 мг/мл). ¦Конечный объем 5,5 мкл.
3. Проинкубируйте 1—2 дня при 12—14 °С.
