Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.6.3. Структурные свойства клонов кДНК
Методика получения двухцепочечной кДНК, приведенная в этой главе, включает стадию обработки нуклеазой S1 [12]. Этот подход основан на том, что затравкой для синтеза второй цепи служит шпилечная структура, образующаяся на З'-конце первой цепи кДНК. Рядом исследователей отмечены связанные с этим подходом структурные аномалии кДНК. Во-первых,, использование нуклеазы S1 для расщепления шпилечной структуры приводит к тому, что в клонах кДНК отсутствуют последовательности, соответствующие 5'-концам мРНК. Несмотря на это, получение из больших библиотек кДНК клонов, содержащих предшествующие точке инициации трансляции (ATG) последовательности, обычно не вызывает затруднений. Вторая структурная аномалия, к которой приводит применение нуклеазы S1, состоит в том, что возможно появление клонов, 5'-кон-цевая последовательность которых не соответствует последовательности мРНК [21]. Причиной этого служит, видимо, неполное расщепление нуклеазой S1. Поэтому полученный с использованием нуклеазы S1 клон необходимо проверять на совпадение всей его последовательности с последовательностью мРНК. Это можно сделать путем S1-анализа, описанного в работе [6]. Обеих указанных выше структурных аномалий 5'-концевых последовательностей можно избежать, используя для получения кДНК методы, специально предназначенные для получения полноразмерных клонов. Эти методы, не использующие нуклеазу S1 [21, 22], по всей видимости, можно применять и при конструировании библиотек в AgtlO и A,gtll.
3. Скрининг библиотек в XgtIO и A,gtf1 зондами на основе нуклеиновых кислот
Скрининг библиотек рекомбинантных ДНК в Х-векторах зондами на основе нуклеиновых кислот проводят при помощи гибридизации этих зондов с репликами фаговых бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах. Скрининг библиотек кДНК про-
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
99
водят также, как и библиотек геномной ДНК- Метод этот хорошо разработан и описан в других руководствах [6, 11]. Там же можно найти методики приготовления фильтров-реплик. После предгибридизации фильтры-реплики обычно инкубируют с меченными 32Р зондами (денатурированными или одноцепочечными) в гибридизационном буфере при температуре, приблизительно на 25 °С меньшей ожидаемой температуры плавления дуплекса, образуемого зондом и фиксированной на фильтре ДНК- Иногда буфер для гибридизации содержит формамид. Для увеличения скорости и эффективности гибридизации в некоторых случаях ее проводят в присутствии дек-странсульфата [23]. После завершения гибридизации фильтры промывают несколько раз; условия отмывки подбирают в зависимости от конкретной цели эксперимента. Затем фильтры высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой.
Применение зондов различного типа связано со стратегией выделения нужного клона кДНК.
1. Если в качестве зонда используется уже клонированный фрагмент ДНК, то содержащую этот фрагмент плазмиду метят методом ник-трансляции. Суть его заключается в замещении нуклеотидов в составе фрагмента ДНК in vitro радиоактивно меченными нуклеотидами при помощи ДНК-полимеразы J Е. coli. Описание этого метода можно найти в работах [6, 11].
2. Зондом может служить смесь олигонуклеотидов, синтезированных химически на основании известной последовательности аминокислот. Если олигонуклеотиды достаточно длинны, можно пометить их 5'-концы и использовать непосредственно для скрининга библиотек кДНК при тщательно подобранных условиях [24]. С другой стороны, поскольку олигонуклеотиды представляют собой фрагменты цепи ДНК, комплементарной матричной РНК, их можно, .индивидуально подобрав условия, отжечь с нефракционированным препаратом poly (А)+-РНК, достроить при помощи обратной транскриптазы и идентифицировать тот из них, который стимулирует синтез нужной последовательности ДНК [25]. Выбрав таким способом затравку, ее используют для синтеза кДНК-зонда при помощи обратной транскриптазы в присутствии меченых нуклеотидов и ро1у(А)+-РНК. Таким способом можно получить высокомеченый одноце-почёчный зонд для скрининга библиотек кДНК-
S. Зонд может представлять собой РНК или одноцепочеч-ную кДНК, полученную путем обратной транскрипции poly(A)+-PHK. Метод получения меченой РНК при помощи киназы описан в работе [26]. Методику приготовления кДНК-зонда можно найти в работе [27]. При использовании в качестве зондов РНК или кДНК в предгибридизационную и гибриди-зационную смеси необходимо вводить полиуридиловую кислоту (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc или Collaborative Research,
7*
100
Глава 2
Inc) в концентрации 250 мкг/мл. Она необходима для блокирования гибридизации зонда с участками клонированных кДНК, соответствующих З'-концевым poly (А)-участкам мРНК.
4. Скрининг библиотек в A,gt11 зондами на основе антител
Скрининг библиотек в Agtll зондами на основе антител проводят после рассева их на газоне клеток Y1090. Клетки Y1090:
1) содержат /ас-репрессор, подавляющий /ас^-зависимую экспрессию генов в тех случаях, когда в среду не добавлен IPTG;
