Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2) дефектны по протеазе Ion, что обусловливает стабильность рекомбинантных белков;
3) несут мутацию supF, супрессирующую фаговую мутацию, обусловливающую дефектность фага-вектора по лизису (SI00).
Некоторые рекомбинантные фаги могут кодировать токсичные для хозяина белки. Чтобы рост таких рекомбинантов избирательно не подавлялся, формирование фаговых бляшек начинается при выключенной экспрессии с промотора lacZ. После того как значительная доля окружающих бляшку клеток окажется зараженной фагом, при помощи IPTG включают lacZ-зависимую экспрессию генов. На поверхность чашки помещают пропитанный IPTG нитроцеллюлозный диск. После нескольких часов инкубации нитроцеллюлозный фильтр, связавший белок лизировавшихся клеток, удаляют с чашки, промывают и инкубируют сначала с раствором антител, а затем для визуализации мест связывания антител — с раствором меченного 125I А-белка из Staphylococcus aureus.
4.1. Реактивы
1. Круглые нитроцеллюлозные фильтры диаметром 82 или 132 мм с размером пор 0,45 мкм (Schleicher and Schuell).
2. Изопропил-^-О-тиогалактопиранозид (Sigma Chemical Company). Приготовьте 1 M раствор в стерильной дистиллированной воде и храните при — 20 °С.
3. Эмбриональная телячья сыворотка (HyClone). Перед использованием профильтруйте через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
4. Меченный 1251 А-белок из Staphylococcus aureus, удельная активность 30 мКи/мг (ICN).
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и Xgtl 1
10t
4.2. Методика скрининга библиотек в Л, gt 11 зондами на основе антител
1. Рассейте Е. coli Y1090 штрихом для получения отдельных колоний на чашках с LB-агаром (pH 7,5), содержащих 50 мкг/мл ампициллина. Проинкубируйте при 37 °С.
2. Отберите индивидуальную колонию Y1090 в пробирку с LB-бульоном (pH 7,5) и инкубируйте при 37° С с хорошей аэрацией.
3. Для каждой чашки диаметром 90 мм смешайте 0,2 мл культуры Y1090 с 0,1 мл разведения фага, содержащего 3-104 б.о.е. библиотеки в Agtll. Для чашек диаметром 150 мм возьмите 0,6 мл бактериальной культуры Y1090 и до 105 б.о.е. Xgtll.
4. Адсорбируйте фаг на клетках 15 мин при 37 °С.
5. Добавьте к культуре 2,5 мл (чашки диаметром 90 мм) или 7,5 мл (чашки диаметром 150 мм) мягкого LB-arapa (pH 7,5) и вылейте смесь на чашки с LB-средой (pH 7,5). Чтобы мягкий агар хорошо прилипал, чашки должны быть сухими (т. е. залиты не менее двух дней назад).
6. Проинкубируйте чашки 3—4 ч при 42 °С.
7. Перенесите чашки на 37 °С, не позволяя им охлаждаться ниже 37 °С.
8. Наложите на каждую чашку круглый нитроцеллюлозный фильтр, заранее пропитанный 10 мМ водным раствором IPTG, а затем высушенный.
9. Проинкубируйте 2—3 ч при 37 °С. (Если нужен дубликат реплики, после удаления первого фильтра наложите новый и продолжайте инкубацию еще 2—3 ч.)
10. Дальнейшие операции можно проводить при комнатной температуре. Быстро отметьте положение фильтра на чашке иглой, смоченной водостойкими чернилами, и осторожно снимите фильтр.
11. На всех последующих стадиях фильтры не должны высыхать. Промывку и инкубацию фильтров проводите при осторожном покачивании сосуда. Сполосните фильтры в TBS (TBS содержит 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 150 мМ NaCl).
12. Проинкубируйте фильтры 15—30 мин в TBS + 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), используя 5 мл смеси на фильтр диаметром 82 мм или 10 мл на фильтр диаметром 132 мм.
13. Проинкубируйте фильтры 1 ч в смеси TBS + 20% эмбриональной телячьей сыворотки + антитела, нанося по 5 мл смеси на фильтр диаметром 82 мм или 10 мл на фильтр диаметром 132 мм. Сывороточные антитела или очищенные IgG (в концентрации 10 мг/мл) разбавьте в 100 раз TBS + 20%
102
Глава 2
телячьей сыворотки. Этот раствор можно использовать несколько раз.
14. Промойте фильтры 5—10 мин в TBS.
15. Промойте фильтры 5—10 мин в TBS + 0,1% NP-40.
16. Снова промойте фильтры 5—10 мин в TBS.
17. Сполосните фильтры TBS + 20% эмбриональной телячьей сыворотки (5 мл на фильтр диаметром 82 мм или 10 мл на фильтр диаметром 132 мм).
18. Перенесите фильтры в TBS + 20% эмбриональной телячьей сыворотки, содержащей меченный 1251 А-белок (Ю6 имп/мин на фильтр диаметром 82 мм, удельная активность 30 мКи/мг). Используйте 5 мл смеси для фильтра диаметром 82 мм или 10 мл — для фильтра диаметром 132 мм. Проинкубируйте 1 ч при комнатной температуре.
19. Промойте фильтры TBS; TBS + 0,1% NP-40, затем снова TBS (см. стадии 14—16).
20. Высушите фильтры и проэкспонируйте с рентгеновской пленкой (Kodak X-Omat AR) и усиливающим экраном (Сгопех Lightning Plug) при—70 °С.
21. Для проверки предполагаемого положительного сигнала
вырежьте столбик агара из участка чашки, соответствующего сигналу на фильтре. Проинкубируйте в фаговом буфере не менее 1 ч. S
22. Рассейте полученный фаг и повторяйте скрининг с антителами до тех пор, пока все бляшки не будут давать положительный сигнал.
