Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
и, во-вторых, накопления чужеродных белков, часто облегчающих лизис Е. coli. Поэтому для каждого индивидуального лизогена следует подобрать максимальное время инкубации при 37—38 °С, при котором лизиса еще не происходит.
5. Как можно быстрее перенесите клетки в центрифугу и осадите в течение 5 мин при 5000 об/мин и 24—37 °С в роторе Beckman JA-10. Для некоторых лизогенов резкое изменение температуры при осаждении клеток приводит к увеличению
Конструирование библиотек в векторах XgtlO и ^gtll_____________105
скорости протеолиза, поэтому центрифугирование проводят при температуре от 24 до 37 °С.
6. Быстро ресуспендируйте клетки в подходящем для белков буфере (1/10—1/20 исходного объема культуры).
7. Немедленно заморозьте суспензию клеток в жидком азоте.
8. Оттаивание замороженных клеток приводит к практически полному лизису индуцированных лизогенов.
5.3. Выделение составного (содержащего фрагмент Р-галактозидазы) белка из неочищенного лизата рекомбинантных лизогенов ^gt11
Если для дальнейшей работы необязательно иметь очищенный антиген, то можно использовать непосредственно лизат, полученный по методике из разд. 5.2. Если же необходим чистый антиген, то составной белок можно очистить несколькими способами. Самый быстрый способ очистки основан на большом размере такого белка (только его (3-галактозидазная часть имеет молекулярную массу 114 кДа). Поскольку немногие белки Е. coli крупнее р-галактозидазы, составной белок можно отделить от других электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Для получения больших количеств денатурированного белка обычно используют препаративные гели. Если чистый антиген необходим в нативной форме, для его очистки применяют стандартные методы хроматографии на колонках.
Благодарности
Мы благодарим всех исследователей, внесших вклад в разработку этих методов. Прежде всего мы приносим благодарность Стюарту Шереру, который, во-первых, указал нам на необходимость разработки Х-вектора для клонирования и экспрессии кДНК, а во-вторых, вместе с Барбарой Мейер предложил использовать hfl-xозяина для селекции против фага cl+imm434. Мы благодарны Дэвиду Кэмпу, на чьей методике основаны начальные стадии процедуры синтеза кДНК, и Томасу Сен-Джону, участвовавшему как в обсуждении процедуры синтеза кДНК, так и в разработке метода скрининга зондами на основе антител. Мы признательны Эндрью Хойту, предоставившему нам мутант hftAl50, и Джереми Натансу за ценные замечания и радиоавтограммы, приведенные на рис. 4 и 6. Мы также благодарим многих исследователей, проверивших приведенные методики и высказавших ценные замечания. Работа финансировалась грантами BARD и NIH 6М 21891, предоставленными Р. Дэвису.
106
Глава 2
Литература
1. Young R. A., Davis R. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194 (1983).
2. Young R. A., Davis R. W., Science, 222, 778 (1983).
3. Murray N. E., Brammar W. ]., Murray K. Mol. Gen. Genet., 150, 53 (1977).
4. Murray N. E. In: Lambda II, Hendrix R. W„ Roberts J. W., Stahl F. W., Weisberg R. A. (eds.). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, p. 395, 1983.
5. Scherer G., Telford J., Baldari L., Pirrotta V. Dev. Biol., 86, 438 (1981).
6. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982. [Имеется русский перевод: Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984.]
7. Hoyt М. A., Knight D. М., Das A., Miller Н. Echols FI. Cell, 31, 565 (1982).
8. Goldberg A. L., St. John A. C. Annu. Rev. Biochem., 45, 747 (1976).
9. Char nay P., Gervais М., Louise A., Galibert F., Tiollais P. Nature, 286, 893 (1980).
10. Kemp D. J., Coppel R. L., Cowman A. F., Saint R. B., Brown G. V., Anders R. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3787 (1983).
11. Davis R. W., Botstein D„ Roth J. R. Advanced Bacteria] Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1980.
12. Efstratiadis A., Kafatos F. С., Maxam A. М., Maniatis T. Cell, 7, 279 (1976).
13. Wickens M. P., Buell G. N., Schimke R. T. J. Biol. Chem., 253, 2483 (1978).
14. Seeburg P. H., Shine J., Martial J. A., Baxter J. D., Goodman H. M. Nature, 270, 486 (1977).
15. Modrich P., Zabel D. J. Biol. Chem., 251, 5866 (1976).
16. Rubin R. A., Modrich P. J. Biol. Chem., 252, 7265 (1977).
17. Murray K-, Murray N. E. J. Mol. Biol., 98, 551 (1975).
18. Wahl G. М., Padgett R. A., Stark G. R. J. Biol. Chem., 254, 8679 (1979).
19. Sealey P. G„ Southern E. M. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL Press, Oxford, p. 39, 1983.
20. Hoopes В. C„ McClure W. R. Nucleic Acids Res., 9, 5493 (1981).
21 Land H. Grez М., Hauser H., Lindenmaier W., Schutz G. Nucleic Acids Res.,
9, 2251 (1981).
22. Gubler U., Hoffman B. J. Gene, 25, 263 (1983).
