Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Методика синтеза двухцепочечной кДНК для клонирования
109
2.1. Синтез первой цепи кДНК
Качество продукта синтеза первой цепи зависит от нескольких факторов; некоторые из них обсуждались в гл. 2. Важным условием для получения высококачественных библиотек кДНК является интактность мРНК. Как показано с помощью блот-гибридизационного анализа РНК с использованием зондов, предназначенных для скрининга библиотеки или зондов на основе имеющихся во многих организмах консервативных последовательностей ДНК (таких, как гены рибосомных белков, актина, тубулина или гистонов), хорошие результаты при выделении мРНК дает метод с использованием гуанидинтиоциана-та [11, 12].
Протокол реакции синтеза первой цепи приведен в табл. 1. Условия реакции очень близки к описанным в гл. 2. Добавление ингибитора рибонуклеазы РНКазина позволяет значительно увеличить длину синтезированной первой цепи. РНКазин из печени или плаценты млекопитающих производится несколькими фирмами.
После этой стадии и стадии синтеза второй цепи следует определить включение в нуклеиновую кислоту радиоактивно меченного нуклеотида. Это можно сделать, если немедленно после добавления всех компонентов реакции, но до начала инкубации нанести две пробы по 2 мкл реакционной смеси на круглые фильтры из бумаги Whatman DE81. По одному из этих фильтров определяют общее количество внесенной радиоактивной метки, а по второму — включение в «нулевой» момент времени. После проведения реакции синтеза кДНК в течение 2 ч при 42 °С (стадия 3, табл. 1) отбираются на бумагу DE81 еще
2 мкл реакционной смеси для того, чтобы определить включение в «нерастворимую» ДНК- Два фильтра, предназначенные для определения «нулевого» включения и включения через 2 ч реакции, промывают следующим образом:
1. 5 раз по 5 мин в 0,5 М Na2HP04.
2. 2 раза по 1 мин в воде.
3. 2 раза по 1 мин в 100%-ном этаноле.
Для промывки фильтры помещают в стакан, содержащий примерно 25 мл промывочной жидкости, и перемешивают в нем. Количество
[32?]
-нуклеотида, включенного в одноцепочечную кДНК, определяют по радиоактивности фильтров с использованием сцинтиллятора и 32Р-канала сцинтилляционного счетчика. Обычно получаемый нами выход продукта синтеза первой цепи составляет 10—50% по весу. Истинный выход к ДНК, по всей видимости, несколько выше, так как использованная нами ро1у(А)+РНК была очищена на oligo(dT)-целлюлозе только один раз, и чистота ее составляла 30—50%.
110
Глава 3
Таблица 1. Синтез первой цепи кДНК
1. Для реакционной смеси объемом 100 мкл прогрейте 10 мкг полнаде-нилированной РНК в 10 мкл воды 5 мин при 65 СС. Охладите пробирку ВО' льду и перенесите РНК в другую пробирку, содержащую 5 мкл исходного раствора актиномицина D!>, предварительно выдержанную для испарения, растворителя в открытом виде на воздухе.
2. Добавьте 20 мкл пятикратного буфера для обратной транскриптазы2),
20 мкл пятикратного d(ACGT)TP3>, 10 мкл раствора oligo(dT) 12-i8 (200мкг/мл, фирма Collaborative Research), 1 мкл 1 М ДТТ4>, 60 ед. РНКазина5>, 100 ед. обратной транскриптазы6), 10 мкКи a[32P]dGTP7> и воду до 100 мкл.
3. Отберите две аликвоты по 2 мкл для определения общей радиоактивности и «нулевого» включения (как описано в тексте) и проинкубируйте пробирку 2 ч при 42°С.
4. Отберите аликвоту (2 мкл) для определения включенной в ДНК радиоактивности и добавьте 5 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8,0; 2,5 мкл 10% SDS; 50 мкл фенола (уравновешенного 100 мМ трис-НС1 pH 7,4) и 50 мкл хлороформа. Перемешайте до образования эмульсии и разделите фазы центрифугированием в микроцентрифуге. Экстрагируйте органическую фазу еще раз 50 мкл ТЕ8). Объедините водные фазы и экстрагируйте их эфиром.
5. К водной фазе добавьте 100 мкл 4М ацетата аммония (пропущенного через нитроцеллюлозный фильтр) и 400 мкл 95%-ного этанола, смешайте и поместите на 15 мин в смесь сухого льда с этанолом.
6. Осадите нуклеиновую кислоту в микроцентрифуге. Тщательно удалите надосадок и растворите осадок в 50 мкл ТЕ. Добавьте 50 мкл 4М ацетата аммония, 200 мкл 95%-ного этанола.
7. Смешайте, охладите и отцентрифугируйте, как описано выше (стадии 5 и 6). Удалите надосадок и высушите осадок в вакууме. Растворите в
30 мкл ТЕ.
8. Отберите аликвоту (2 мкл) для определения длины кДНК гель-электрофорезом.
]) Актиномндии D (Calbiochem) растворите в 80%-ном этаноле в концентрации 800 мкг/мл.
2) Пятикратный буфер для обратной транскрипции содержит 250 мМ трис-НС1 pH 8,3 (42 °С), 40 мМ MgCl2, 250 мМ КС1.
3 Пятикратный d(ACGT)TP — это раствор, содержащий каждый из дезоксииуклеознд-трифосфатов (PL) в концентрации 5 мМ. Мы готовим растворы каждого из трифосфатов. в коицентрацнн 20 мМ в 10 мМ трис-НС1 pH 7,5.
4) 1 М раствор ДТТ перед употреблением фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану.
6) РНКазнн (фирмы Biotech) в концентрации 30 ед/мкл. Одна единица ингибирует на Е0% активность 5 нг РНКазы А.
