Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Глава 2
8 ходе конструирования библиотеки. Для увеличения доли рекомбинантов имеются два способа. Простейший и дающий наилучшие результаты подход состоит в том, что лигирование вставки и вектора проводят в минимальном объеме и таким •образом, чтобы чужеродная ДНК присутствовала в молярном избытке над вектором. Например, при лигировании 1 мкг рест-рицированной ?coRI ДНК Agtll с 0,5 мкг кДНК в объеме
2 мкл можно получить библиотеку, в которой доля рекомбинантных фагов составляет ~30%. Следует, однако, помнить, что при таком высоком соотношении вставка/вектор могут появляться рекомбинантные молекулы, содержащие более одной вставки. Второй способ предусматривает обработку векторной ДНК щелочной фосфатазой для удаления необходимого при лигировании б'-концевого фосфата. После этого два плеча вектора не могут лигироваться друг с другом в отсутствие вставки. К сожалению, качество большинства коммерческих препаратов ¦щелочной фосфатазы таково, что после обработки ими нередко заметно снижается жизнеспособность вектора. Поэтому при использовании щелочной фосфатазы необходимо подобрать минимальное количество фермента, приводящее к уменьшению способности расщепленного ?coRI вектора к лигированию (в отсутствие вставки) на 90—95%.
2.6. Примеры получаемых результатов
2.6.1. Эффективность клонирования кДНК
Сведения об эффективности клонирования кДНК, которой удалось добиться разным исследователям с помощью описанной выше методики и вектора AgtlO, приведены в табл. 10. Аналогичные данные для вектора A,gtll приведены в табл. 11. Средняя по двум таблицам эффективность составляет 6,6-105
Таблица 10. Эффективность клонирования кДНК в XgtlO
Источник ро!у(А)+РНК Число клонов
на 1 мкг
ро1у(А)+РНК
Проростки кукурузы1) 2,5-105
Побеги гороха2' 3,0-105
Дрожжи3» 7,5-105
Нематоды4' 5,0-105
Сетчатка глаза быка5) 1,3-105
*) Т. Кхунь, неопубликованные данные.
2) А. Теологис, личное сообщение.
3) Р. Янг, неопубликованные данные.
4) Б. Мейер, личное сообщение.
5) Дж. Натане, личное сообщение.
Конструирование библиотек в векторах A,gtlO и A,gtll
97
Таблица 11. Эффективность клонирования кДНК в bgtll
Источник Число клоиов Доля от общего
ро!у(А)+РНК - иа ,1 мкг числа б.о.е.
ро1у(А)+РНК в библиотеке, %
Дрожжи1* 1,5-106 15%
Нематоды2^ 1,2-106 8%
J) Р. Янг, неопубликованные данные.
2) Б. Мейер, личное сообщение.
рекомбинантов на 1 мкг полиаденилированной РНК- Эти результаты показывают, что при использовании Я-векторов вполне возможно конструирование библиотек из 105—106 рекомбинантов при наличии лишь нескольких микрограммов ро1у(А)+-РНК. Такие библиотеки достаточно велики для того, чтобы содержать последовательности, соответствующие даже самым редким мРНК.
Эффективность клонирования кДНК прямо зависит от качества используемых реагентов. Один из важнейших параметров— качество poly (А)+РНК-матрицы. Перед использованием poly(A)+PHK для синтеза кДНК ее необходимо тщательно проверить на отсутствие следов деградации. Необходимо также иметь высококачественные, концентрированные препараты ферментов, не загрязненные нуклеазами и фосфатазами. Многие исследователи предпочитают коммерческим препаратам самодельные ферменты. Еще один важный фактор — качество экстрактов для упаковки in vitro. Приведенные в табл. 10 и 11 эффективности клонирования получены с использованием экстрактов, дающих от 5-107 до 108 бляшкообразующих единиц на
1 мкг векторной ДНК. С появлением лучших методов приготовления упаковочных экстрактов эффективность клонирования кДНК может существенно возрасти.
2.6.2. Размер клонированных кДНК
Для того чтобы убедиться, что составляющие библиотеку фаги действительно содержат вставки, из 24 случайно выбранных бляшек библиотеки кДНК кукурузы (табл. 10) выделили ДНК и рестрицировали ее ?coRI. ДНК, полученная из всех 24 фаголизатов, содержала фрагменты-вставки со средней длиной 650 п.н.
Эта цифра означает, что средняя длина вставки меньше, чем длина структурного гена. Средняя длина клонированных кДНК в значительной степени зависит от того, какая фракция кДНК после фракционирования ее по размеру была выбрана
7—196
98
Глава 2
для лигирования. Многие исследователи, работающие как с зондами на основе нуклеиновых кислот, так и с антителами,, считают, что библиотека, состоящая в основном из клонов неполных кДНК, вполне приемлема для выделения нужных генов. После выделения клона нужной кДНК. его в свою очередь используют в качестве зонда для поиска более длинных клонов. С помощью такого метода последовательных приближений из большой библиотеки кДНК обычно удается выделить клон, содержащий полную кодирующую область искомой мРНК.
