Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Методика синтеза двухцепочечной кДНК для клонирования
11$
второй цепей, можно определить при помощи электрофореза в щелочном агарозном геле, как описано в разд. 2.5.3 гл. 2. ДНК можно перенести из геля на лист бумаги DE81 так же,, как при ускоренном переносе по Саузерну. Положите гель на кусок поливинилхлоридной пленки, наложите сверху лист бумаги DE81, затем стопку фильтровальной бумаги, стеклянную пластинку и груз. Через 2 ч бумагу DE81 снимите, высушите в сушке для гелей и радиоавтографируйте. Нейтрализовать гель необязательно.
2.3. Подготовка двухцепочечной кДНК к лигированию с вектором
Приведенные методики, аналогичные описанным в предыдущей главе и подробно изложенные в табл. 3, включают в. себя:
Таблица 3. Подготовка кДНК к лигированию с вектором
A. Реакция достройки концов
1. Ресуспендируйте кДНК в 25 мкл раствора, полученного на последней стадии табл. 2. Добавьте 1 мкл пятикратного d (ACGT)TP1), 1 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA — от англ. bovine serum albumin) (2 мг/мл, фирмы Pentex, свободный от нуклеаз), 9 единиц ДНК-полимеразы Т42) и 3 мкл десятикратного буфера для полимеразы Т43). Конечный объем реакции 30 мкл.
2. Проинкубируйте 30 мин при 37 °С и добавьте 30 мкл фенола и 30 мкл хлороформа. Встряхните и отцентрифугируйте для разделения фаз. Экстрагируйте фенольную фазу дополнительно 30 мкл ТЕ.
3. Экстрагируйте эфиром и осадите ДНК этанолом, как описано в табл. I (стадия 3). Ресуспендируйте полученный осадок в 4,8 мкл воды.
Б. Метилирование EcdRl-еайтов
1. К ресуспендированной в 4,8 мкл Н20 кДНК добавьте 1 мкл раствора
SAM4) (1 мкКи), 2 мкл пятикратного буфера для метилазы5', 2 мкл раствора
BSA (2 мг/мл), 0,2 мкл метилазы ?coRI (26 ед.6>/мкл).
2. Проинкубируйте 20 мин при 37 °С. Экстрагируйте смесью фенол/хлороформ, повторно экстрагируйте органическую фазу, объедините водные фазы, экстрагируйте их эфиром и осадите этанолом (см. стадии 4—8 табл. 1).
3. Соберите осадок центрифугированием, слейте надосадок и высушите осадок в вакууме.
B. Присоединение линкеров к кДНК
1. Ресуспендируйте осадок в 5 мкл однократного буфера для киназы7),.
5 мкл фосфорилированных линкеров (500 нг)8) и 0,2 мкл раствора АТР
(22 мМ).
2. Добавьте 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4 (400 ед.9>/мкл) и проинкубируйте ночь при 14 °С.
Г. Расщепление присоединенных к кДНК линкеров и удаление их избытка
1. Прогрейте реакционную смесь для лигирования 10 мин при 65 °С. Отцентрифугируйте несколько секунд для осаждения капель конденсата. Добавьте 1,5 мкл 1 М трис-НС1 pH 7,5; 1 мкл 1 М NaCl (профильтрованного через нитроцеллюлозный фильтр) и 5,6 мкл воды.
2. Добавьте 140 единиц10) ?coRI и проинкубируйте 2 ч при 37 °С.
8—196
>114
Глава 3
Продолжение
3. Добавьте 30 мкл ТЕ и экстрагируйте смесью фенол/хлороформ. Экстрагируйте органическую фазу еще дважды 50 мкл ТЕ. Водную фазу экстрагируйте трижды эфиром, внесите 15 мкл 2М ацетата натрия и 450 мкл этанола. Охладите до —70 °С и осадите ДНК в микроцентрифуге. Удалите лвдосадок и высушите осадок в вакууме.
4. Растворите осадок в 20 мкл 0,4 М NaCl; 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 1 мМ ЭДТА (STE) и 2 мкл глицерина с бромфеноловым синим. Отделите кДНК от избытка линкеров путем гель-фильтрации на колонке с Ultrogel АсА34 (LKB) объемом 1 мл; Колонку, изготовьте из оттянутой и силикони-рованной пастеровской пипетки, в которую поместите пробку из силикони-рованной стекловаты. Колонку уравновесьте буфером STE. Проведите элюцию тем же буфером, собирая фракции по 100 мкл. Определите радиоактивность фракций и соберите материал, соответствующий пику кДНКИ).
') Состав пятикратного d(ACGT)TP описан в примечании 3 к табл. 1.
2) 1 единица ДНК-полимеразы Т4 катализирует включение 10 нмолей нуклеотидов в кислотонерастворимый продукт за 30 мин при 37 °С. Авторы пользуются ферментом фирмы PL Biochemicals.
3) Десятикратный буфер для полимеразы Т4 содержит 330 мМ трнс-ацетата pH 7,9; 660 мМ ацетата калня; 100 мМ ацетата магния; 1 мг/мл BSA (фирма Pentex, свободный от нуклеаз); 5 мМ ДТТ.
4) SAM — $-адеиозил-1^1метил-5Н]метионин фирмы Amersham (удельная активность 15 Ки/ммоль). SAM, поставляемый другими фирмами, часто бывает загрязнен S-адено-зилгомоцистеином, который ингибирует метилазу.
5) Пятикратный буфер для метнлазы содержит 500 мМ трнс-НС1 pH 8,0; 5 мМ ЭДТА pH 8,0.
6) 1 ед. метилазы ?coRI — это количество фермента, необходимое для защиты от расщепления рестриктазой ?coRI 1 мкг ДНК фага % за 1 ч при 37 °С и объеме реакционной смеси 10 мкл. Авторы используют фермент фирмы New England Biolabs.
7) Состав буфера для кнназы приведен в тексте разд. 2.3.
8) Фосфорилирование линкеров описано в тексте разд. 2.3.
9) 1 ед. ДНК-лигазы Т4 — это количество фермента, необходимое для 50%-ного лигирования расщепленной Hindlll ДНК фага X за 30 мин при 16 °С в объеме 20 мкл при концентрации концов 0,12 мМ (—330 мкг/мл). Авторы используют фермент фирмы New England Biolabs.
