Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 50

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 253 >> Следующая

10) 1 ед. EcoRI — это количество фермента, необходимое для расщепления 1 мкг ДНК фага X за 1 час при 37 °С в соответствующем буфере. Авторы используют высококонцентрированный фермент фирмы Boehringer.
и) Подробная методика гель-фильтрации приведена также в разд. 2.5.8 предыдущей главы.
1) достройку всех незавершенных концов кДНК для того, чтобы к ним можно было присоединить химически синтезированные линкеры и образовать на концах молекул участки расщепления .EcoRI;
2) защиту внутренних EcoRI-сайтов от расщепления ферментом с помощью модификации метилазой .EcoRI;
3) присоединение к кДНК. линкеров;
4) обработку EcoRI для удаления избытка линкеров, образовавших при лигировании олигомеры, и для формирования у молекул кДНК липких EcoRI-концов.
Перед присоединением к кДНК линкеры метят радиоактивными изотопами. Реакцию проводят в объеме 50 мкл с помощью полинуклеотидкиназы Т4, как описано ниже.
1. Приготовьте реакционную смесь (50 мкл), содержащую
5 мкл дефосфорилированных EcoRI-линкеров (5 мкг), 5 мкл свежеприготовленного десятикратного буфера для киназы (100 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ MgCl2; 100 мМ ДТТ; 10 мМ.
Методика синтеза двухцепочечной кДНК для клонирования
115
АТР), 36 мкл воды, 1 мкл [^-32Р] АТР с высокой удельной активностью (10 мкКи) и 3 мкл полинуклеотидкиназы Т4 (15 единиц, фирма Boehringer). 1 единица фермента катализирует включение 1 нмоля 32Р в кислотонерастворимый продукт за 30 мин при 37 °С.
2. Проинкубируйте 1 ч при 37 °С, разделите на аликвоты по 5 мкл и заморозьте при —20 °С.
Реакцию фосфорилирования концов следует проконтролировать. Для этого лигируйте аликвоту раствора линкеров и обработайте часть этой аликвоты рестриктазой ?coRI. Продукты проанализируйте с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле, как описано в разделе 2.5.6 гл. 2, либо электрофорезом в 6%-ном геле для определения нуклеотидной последовательности ДНК (6% акриламида, 7 М мочевины). В последнем случае электрофорез следует вести до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не достигнет середины геля. В результате лигирования линкеры должны образовать «лестницу» из сшитых олигомеров разной длины. После обработки ?coRI все олигомеры должны расщепиться до мономеров. Не забудьте перед рестрикцией инактивировать лигазу, прогрев реакционную смесь в течение 5 мин при 70 °С.
2.4. Лигирование кДНК с векторной ДНК
Расщепление ДНК инсерционного А,-вектора рестриктазой ?coRI и лигирование его с кДНК описаны в табл. 4.
3. Упаковка in vitro и рассев гибридных фагов
Рекомбинантная ДНК после стадии 2 таблицы 4 готова для упаковки в частицы фага in vitro. В этой главе мы не рассматриваем эти методики, так как упаковка in vitro описана в работе [13], а рассев содержащих кДНК рекомбинантных фагов, описывается в предыдущей главе, начиная с разд. 2.5.12.
4. Заключительные замечания
При выборе системы вектор — хозяин для клонирования
кДНК необходимо учесть несколько факторов. Действие сис-
темы рекомбинации как хозяина, так и вектора, может приво-
дить к перестройкам последовательностей и при первичном
рассеве, и при амплификации. Клетки hfl имеют генотип гесА+,
a Xgt 10 и Xgt 11 — red+. Для того чтобы избежать нестабиль-
ности, наблюдающейся, например, при клонировании в red+-
векторах (Xgtll) кДНК-копий мРНК, содержащих короткие
тандемно повторяющиеся последовательности, можно исполь-
зовать вектор red* (Дж. Скейф, личное сообщение, и [14]) .
Л16
Глава 3
Таблица 4. Лигирование кДНК и векторной ДНК
А. Расщепление ДНК инсерционного %-вектора
1. Расщепите около 50 мкг ДНК вектора с помощью 6 мкл ?coRI (140 ед./мкл) в течение 2—3 ч при 37 °С; объем реакционной смеси 300 мкл.
2. Экстрагируйте смесью фенола с хлороформом, затем экстрагируйте органическую фазу и осадите ДНК этанолом, как описано в табл. 1 (стадии 4—8), но при комнатной температуре.
3. Соберите ДНК центрифугированием, удалите надосадок, осадок высушите и растворите в 50 мкл ТЕ.
Б. Лигирование вектора и кДНК
1. Молярное соотношение вектора и кДНК должно быть около 2:1, т. е. приблизительно 5 мкг ДНК плеч вектора должно приходиться на 100 нг кДНК (считая, что средний размер кДНК составляет 2000 п.п.). Большие соотношения также допустимы. В идеале концентрация ДНК при лигировании должна быть не менее 1 мг/мл.
Соосадите кДНК и плечи вектора этанолом. Охладите в смеси сухого льда с изопропанолом и соберите ДНК центрифугированием. Удалите надосадок, высушите осадок и растворите его в 3,5 мкл воды. Добавьте 0,5 мкл десятикратного буфера для лигирования2); 0,5 мкл 10 мМ АТР и 0,5 мкл (200 ед.) ДНК-лигазы Т4. Так как работать с большими объемами легче, можно проводить реакцию в двойном масштабе, т. е. использовать 10 мкг ДНК плеч вектора и 200 нг кДНК. Инкубируйте смесь в течение ночи при 14 °С.
2. Разбавьте реакционную смесь ТЕ до 50 мкл и прогрейте 5 мин при 65 °С. ДН,К готова для упаковки.
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed