Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.3. Комментарии к методике скрининга библиотек антителами
1. Для выделения генов из библиотек в Xgtll, сконструированных с использованием кДНК, или геномной ДНК разных организмов — от бактерий до млекопитающих, — с успехом использовались поликлональные антитела. Большую роль при этом играет качество зонда. Поликлональные антитела имеют преимущество перед моноклональными, так как антитела поликлональной популяции обычно узнают множество эпитопов. Как и следовало ожидать, антитела с высоким титром дают лучшие сигналы, чем антитела с низким титром. Как правило, антитела, дающие хороший сигнал при вестерн-блот-анализе, хороши и для скрининга библиотек в Agtll.
2. Поликлональные антитела часто содержат компоненты, связывающиеся с продуцируемыми в норме антигенами Е. coli. Чтобы уменьшить такое «фоновое» связывание, эти компоненты следует удалить из препарата антител. Лучше всего проинкубировать антитела с лизатом Е. coli, иммобилизованным на се-фарозе (например, активированный CNBr) либо на нитроцел-люлозных фильтрах. Приготовьте лизат Е. coli BNN97 методом,
Конструирование библиотек в векторах A,gtlQ и Xgtll
103
описанным в разд. 5. Для уменьшения вязкости обработайте его ультразвуком или ДНКазой. Иммобилизуйте его на активированной CNBr сефарозе согласно инструкции фирмы-изготовителя. Для иммобилизации на нитроцеллюлозных фильтрах просто погрузите фильтры в лизат, а затем промойте их TBS. Разбавьте антитела приблизительно в 10 раз TBS + 20% эмбриональной телячьей сыворотки и проинкубируйте их с сефа-розой или фильтрами 15—30 мин. Отделите антитела от твердого носителя (для удаления гранул сефарозы достаточно центрифугирования) и повторите операцию с новой порцией сефарозы или фильтров. Для удаления из антител основной массы анти-Е. coli компонента обычно хватает двух промывок. Так как в процессе скрининга раствор антител используется неоднократно, остатки анти-i;. coli компонента удаляются и в ходе использования зонда. Поэтому по мере использования зонда фон уменьшается.
3. Препарат разведенных антител можно использовать неоднократно. С одним и тем же препаратом иногда можно провести до десяти операций скрининга.
4. Хотя эмбриональная телячья сыворотка — прекрасный протектор для антител, ее можно заменить намного более дешевым препаратом — альбумином куриного яйца (10 мг/мл). Пока еще, однако, не вполне ясно, работает ли он так же хорошо, как сыворотка, при многократном использовании антител.
5. Получение рекомбинантного антигена из бактерий, лизогенизированных рекомбинантным фагом ^gt11
Часто требуется получить в препаративных количествах полипептид, кодируемый клонированным участком ДНК. В некоторых случаях (например, для радиоиммунологического анализа) достаточно неочищенного лизата Е. coli, содержащего кодируемый нужным клоном антиген. Лизат, содержащий рекомбинантный антиген, можно получить при экспрессии рекомбинантного фага Igtll в лизогене Е. coli Y1089. Клетки Y1089;
1) содержат lac-репрессор (продукт гена lad), подавляющий lacZ-зависимую экспрессию генов в тех случаях, когда в среде отсутствует IPTG;
2) дефектны по протеазе Ion, что повышает стабильность рекомбинантных белков;
3) несут мутацию, увеличивающую частоту лизогенизации (hflA 150).
Для получения рекомбинантного белка клетки Y1089 лизо-генизируют нужным клоном Xgtll. Лизогенную культуру ин-
104
Глава 2
кубируют до высокой плотности клеток, индуцируют lacZ-зависимую продукцию составного белка добавлением IPTG, затем клетки собирают и лизируют.
5.1. Лизогенизация клеток Y 1089 рекомбинантным фагом
1. Инкубируйте клетки Y1089 в LB-бульоне (pH 7,5), содержащем 0,2% мальтозы.
2. Инфицируйте клетки рекомбинантным фагом A,gtll: множественность инфекции ж 5, адсорбция в течение 20 мин при 32 °С в LB-бульоне (pH 7,5), содержащем 10 мМ MgCb.
3. Посейте клетки на LB-агар (pH 7,5), так чтобы на одну чашку приходилось примерно 200 клеток, и инкубируйте при 32 °С (при этой температуре функционирует температурочувствительный репрессор фага).
4. Выросшие индивидуальные колонии проверьте на чувствительность к температуре 42 °С. Для этого с помощью стерильных зубочисток переколите колонии на две LB-чашки (pH 7,5). Проинкубируйте одну из них при 42 °С, а другую — при 32 °С.
5. Клоны, растущие при 32 °С, но не растущие при 42 °С, можно считать лизогенами. Частота появления лизогенов составляет 10—70% •
5.2. Приготовление неочищенного лизата из рекомбинантных лизогенов A,gt11
1. Засейте 100 мл среды LB (pH 7,5) отдельной колонией рекомбинантного лизогена Y1089. Проинкубируйте при 32 °С с хорошей аэрацией.
2. Когда оптическая плотность культуры при 600 нм достигнет 0,5, как можно быстрее поднимите температуру до 42— 45 °С и при этой температуре проинкубируйте культуру 20 мин с хорошей аэрацией.
3. Добавьте IPTG до 10 мМ.
4. Проинкубируйте культуру примерно 60 мин при 37—
38 °С. (Не охлаждайте культуру ниже 37 °С.) Иногда на этой стадии лизоген Y1089 лизируется несмотря на то, что клетки Y1089 не супрессируют мутацию Xgtll, обусловливающую дефектность по лизису (5100). Это может быть следствием, во-первых, неполного блокирования лизиса атбег-мутацией S100
