Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
478
Глава 7
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12
а ФФ #•••• ••• 6 »• ••••
?
1 2 3 4 b 8 / 8 9 10 11 1?
5« ••••• •••#
Рис. 4. Л. Идентификация VSV ДНК, клонированной в составе рекомбинантного вируса оеповакцины, 24 небольших монослоя, инфицированных ТК--вирусами (а 1—12, б 1—12), перенесли на нитроцеллюлозу и гибридизовали с меченной 32Р кДНК гликопротеина VSV (разд. 2.4.3). Результаты радиоавтографии свидетельствуют о том, что 20 из 24 монослойных культур были инфицированы вирусами, содержащими ген гликопротеина VSV. Б. Идентификация продуктов экспрессии гликопротеина VSV в рекомбинантном вирусе осповак-цины, 24 небольших монослоя (а А—12, б 1—12), инфицированных параллельно с серией (Л), экстрагировали NP-40, затем наносили экстракты на нитроцеллюлозу и тестировали на присутствие гликопротеина VSV (VSVG) с помощью анти-УБУО-антител и меченного 1251 белка А (разд. 2.4.4). По результатам радиоавтографии 20 из 24 монослоев были инфицированы рекомбинантными вирусами, экспрессирующими VSVG. Экспозиция составляла: А—6 ч, Б — 48 ч (пленка Kodak XAR5).
ментом по дот-гибридизации ДНК. Те же самые ТКгбляшки были высеяны на клетки 143 ТКН, выращенные в 1,5 см2 ячейках (в 24-луночном планшете) в присутствии 25 мкг/мл BUcLR. Иммунно-дот-анализ следует проводить следующим образом.
1. Удалите среду с клеток и лизируйте их 100 мкл раствора: ¦0,1 М трис-НС1 pH 8,0; 0,1 М NaCl; 0,5% NP-40; 0,1% Aprotinin.
2. По 25 мкл каждого лизата нанесите на нитроцеллюлозу, после чего фильтр высушите на воздухе.
3. Инкубируйте фильтр в течение 2 ч на качалке в 50 мл фосфатно-солевого буфера A (PBSA, Difco), содержащего 4%
¦ фосфатно-^солевого буфера (BSA) и 0,02% азида натрия.
4. Добавьте антисыворотку, специфичную к продукту клонированного гена (в данном случае — антигликопротеиновую VSV NJ), и инкубируйте еще в течение 2 ч на качалке.
5. Промойте фильтр 5 раз по 2 мин 50 мл PBSA.
6. Инкубируйте фильтр при мягком покачивании в течение
2 ч в PBSA, содержащем 4% BSA; 0,02% азида натрия и 1 мкКи меченного [1251] стафилококкового белка А.
7. Промойте фильтр 5 раз по 2 мин 50 мл PBSA, высушите на воздухе и экспонируйте с рентгеновской пленкой.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
479"*
Некоторые препараты моноклональных антител, которые могут использоваться в качестве первых антител при иммунодетекции, не связывают белок А. Это препятствие преодолевают следующим образом. После инкубации с первыми антителами и, промывки фильтры обрабатывают поликлональными кроличьими^ антителами к мышиным IgG и уже затем инкубируют с меченым белком А. Альтернативным способом являются использование конъюгированных с пероксидазой антител к мышиным IgG и последующая детекция специфического связывания с помощью реакции с соответствующим хромогенным субстратом. Как видно из рис. 4, Б, те же 20 бляшек, которые дали положительный сигнал с ДНК VSV, экспрессируют продукт клонированного гена. Чувствительность ДНК-гибридизационного теста несколько выше, чем теста с применением антител, однако иммунодетекция имеет то преимущество, что, во-первых, требует меньше времени на постановку эксперимента и, во-вторых, позволяет непосредственно убедиться в том, что клонированный ген не только встроился в вирусный геном, но и экспрессируется в данной системе.
2.5.5. Выявление индивидуальных рекомбинантных бляшек в монослое
Альтернативой описанным методам, предусматривающим первоначальную селекцию рекомбинантных вирусов по их фенотипу, является прямое выявление рекомбинантных бляшек с помощью ДНК-гибридизации in situ или путем тестирования с помощью антител на экспрессию чужеродного гена.
Полученный после трансфекции вирусный препарат высевают на свежий клеточный монослой в таком разведении (табл. 1) (обычно с верхним агаром), чтобы на 9-см чашке получить приблизительно 100 бляшек. Если ожидаемый процент рекомбинантов мал, можно увеличить количество бляшек на монослое; если; же при этом число бляшек на одной чашке будет превышать 500, следует уменьшить время инкубации инфицированного монослоя с 48 до 36 или даже до 24 ч. После того как бляшки сформировались, приготавливают реплику с монослоя на нитроцеллюлозный фильтр.
1. Сухой круглый нитроцеллюлозный фильтр диаметром 8 см осторожно наложите на влажный клеточный монослой с вирусными бляшками в 9 см культуральной чашке.
2. Когда фильтр полностью промокнет, наложите поверх него на несколько минут лист Whatman ЗММ, пропитанный 2XSSC.
3. Плотно и равномерно прижмите фильтры к чашке и затем аккуратно снимите ЗММ и нитроцеллюлозу, к которой теперь, прикреплен клеточный монослой. Полезно предварительно окрасить монослой 0,05%-ным нейтральным красным — это позволяет легко контролировать перенос клеток на нитроцеллюлозу.
*480
Глава 7
4. Поместите фильтр клеточным слоем вверх на 3 мин последовательно на листы ЗММ, пропитанные: а) 0,5 М NaOH; б) 1 М трис-HCl р 7,5; в) 2XSSC. Прогрейте фильтр при 80°С в течение 2 ч.
