Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
j
Рекомбинантные конструкции на основе вируса оеповакцины_________465-
жет целиком проходить в цитоплазме клетки, поскольку вирусные частицы обеспечивают производство необходимых ферментов для синтеза и посттранскрипционной модификации РНК5 а также для синтеза ДНК. Таким образом, вирусы оспы обладают рядом необычных биологических черт, которые следует учитывать при разработке на их основе векторов для молекулярного клонирования и экспрессии клонированных генов.
Поначалу основными техническими проблемами, с которыми пришлось столкнуться при разработке векторов для клонирования и экспрессии генов на базе вируса оеповакцины, были введение ДНК в геном вируса, эффективная экспрессия чужеродных генов и селекция рекомбинантов. Большой размер вирусного генома делает задачу создания рекомбинантной конструкции in vitro чрезвычайно трудной для практического выполнения. Даже если бы ее и удалось решить, изолированная вирусная ДНК, по-видимому, не обладала бы инфекционностью, поскольку интактные вирусные частицы содержат ферменты, необходимые для транскрипции вирусной ДНК. Таким образом, получить инфекционный рекомбинантный вирус на основе сконструированного in vitro рекомбинантного генома весьма а весьма трудно. Проблему введения чужеродной ДНК в вирусный геном удалось решить, используя гомологичную рекомбинацию в инфицированных клетках между рекомбинантными плазмидами, содержащими вирусные последовательности, и геномом вируса.
Хотя для вируса оеповакцины сигналы транскрипционного контроля не идентифицированы, было показано, что области, предшествующие некоторым вирусным генам, сильно обогащены АТ-парами, что является существенным отличием от усредненных эукариотических промоторных последовательностей [5]. Получается, что вирусная РНК-полимераза узнает только «свои» уникальные регуляторные последовательности, а потому эффективную экспрессию чужеродных генов в вирусе оеповакцины, по-видимому, можно получить в том случае, если использовать именно эти контролирующие генетические элементы.
Рекомбинантные вирусы составляют лишь очень небольшую часть общего пула вирусных частиц; идентифицировать их можно методом гибридизации бляшек (разд. 2.4.5.). Альтернативой тотальному скринингу может служить селекция рекомбинантов. Один из возможных путей реализации этого подхода — клонирование интересующего гена внутри тимидинкиназного гена (tk) вируса. Для селекции 7Уе_-рекомбинантов используют 5-бромдезоксиуридин (BUdR). Когда первые методические-трудности удалось преодолеть, сразу несколько групп исследователей сообщили о получении рекомбинантных конструкций на базе вируса оеповакцины, экспрессирующих чужеродные гены [6—12].
30—196
466
Глава 7
2. Конструирование рекомбинантных вирусов
2.1. Стратегия
Мы сконструировали рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие чужеродные' гены. Существенно, что процесс ¦создания таких вирусов включал две стадии. Сначала путем генно-инженерных манипуляций мы получили рекомбинантную плазмиду (инсерционный вектор), которая содержала гибридный ген, фланкированный вирусными последовательностями ДНК- Гибридный ген представлял собой кодирующую белок зону чужеродного гена, с которой были состыкованы область инициации транскрипции и предшествующие этой области дистальные контролирующие последовательности из генома вируса.
Рис. 1. Получение рекомбинантных вирусов осповакцины. Клетки, инфицированные вирусом осповакцины, трансформируют ДНК рекомбинантных плазмид. Эти конструкции содержат промотор вируса осповакцины (на рисунке обозначен белым прямоугольником), состыкованный в соответствующей ориентации с кодирующей частью чужеродного гена (волнистая линия); -такой функциональный блок в составе плазмиды фланкирован последовательностями вирусной ДНК. Между фланкирующими последовательностями и вирусным геномом происходит гомологичная рекомбинация, вследствие чего чужеродный ген оказывается в составе вирусной ДНК. Рекомбинантные ге-•номы упаковываются в вирусные частицы — формируются рекомбинантные
вирусы.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса оеповакцины
46^
Рис. 2. Расположение участков интеграции чужеродных генов в геноме вируса’ оеповакцины. Показаны все //mdIII-сайты, соответствующие рестрикционные фрагменты обозначены в порядке убывания молекулярной массы. Показана также примерная локализация вирусных генов tk и 7,5К-белка. Детализация» трех сайтов приведена в работах [6], Г91 и [12]. Внизу изображен WmdlllC-фрагмент в более крупном масштабе. В таком же масштабе показаны HindlllF-и ffindlllJ-фрагменты. ITR — инвертированные концевые повторы в составе вирусной ДНК; TR — тандемные повторы; применены следующие сокращенные обозначения рестрикционных сайтов: В — Bam HI; Е —?coRI; Bg — Bglll;.
P — Pstl.
Таким образом, при введении в геном вируса гибридный ген. должен нормально транскрибироваться и образующаяся мРНК. будет транслироваться в аутентичный чужеродный белок. Введение гибридного гена в вирусный геном удалось осуществить путем трансфекции инфицированных вирусом дикого типа клеток плазмидным инсерционным вектором. В результате гомологичной рекомбинации между вирусными последовательностями, ограничивающими гибридный ген, и вирусным геномом возник, рекомбинантный вирусный геном, в состав котррого вошел гибридный ген. Схема описанного эксперимента представлена на рис. 1. Последовательности вирусной ДНК, фланкирующие гибридный ген, определяют область интеграции этого гена в вирусный геном. Понятно, что чужеродный ген должен интегрироваться в участок генома, несущественный для развития вируса, в культуре ткани. Ко времени написания этой главы для введения чужеродных генов были апробированы три участка вирусного генома [6, 9] (рис. 2, обозначены звездочкой). Хотя они и оказались приемлемыми для клонирования (по-видимому, в этих, целях можно использовать любую несущественную область вирусного генома), мы предпочитаем вводить чужеродные гены в вирусный ген tk, чтобы обеспечить возможность селекция ТЩ~-рекомбинантов с помощью BUdR.
