Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 225

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 219 220 221 222 223 224 < 225 > 226 227 228 229 230 231 .. 253 >> Следующая

476
Глава 7
в дальнейшем широко использовали имено эта клетки для селекции как ТК+-, так и 77С--рекомбинантных вирусов осповакци-ны (см. следующий раздел).
2.5.2. Селекция рекомбинантов, содержащих клонированный ген в составе вирусного гена ТК
Альтернативный метод получения рекомбинантов предполагает внедрение клонированного гибридного гена в вирусный ген tk\ отбор рекомбинантных вирусов здесь производится по фенотипу ТК~ на 7Ж_-клетках в присутствии BUdR. Мы сконструировали ряд инсерционных векторов (см. рис. 3), в составе которых кодирующая последовательность вирусного гена tk прерывается полилинкером с уникальными рестрикционными сайтами и состыкованным с ним вирусным промотором. Эти векторы используйте при работе по следующей схеме.
1. Получите рекомбинантные плазмиды на основе данных векторов: интересующий ген встройте в один из рестрикционных сайтов в составе полилинкера. Рекомбинантные ДНК введите путем трансфекции в инфицированные вирусом осповакцины клетки по стандартной методике, описанной в табл. 5.
2. Высейте пятую часть полученного вирусного препарата на клетки ТК~ ИЗ, как описано в табл. 2. На стадии 2 используйте 1%-ную легкоплавкую агарозу, содержащую 5% FCS, МЕМ и 25 мкг/мл BUdR.
3. Через 48 ч после инфицирования окрасьте клеточный монослой нейтральным красным, чтобы визуализировать бляшки, образованные 77(~-вирусом (табл. 2, стадия 3).
4. Отберите «24 хорошо изолированные бляшки и инфицируйте небольшие монослои (1,5 см2; 1—2-105 клеток) ТК~ 143. в присутствии 25 мкг/мл BUdR.
Последнюю процедуру удобно проводить в 24-луночных планшетах (стадия 6, табл. 2; стадии 4 и 5, табл. 1). Присутствие фрагмента чужеродной ДНК в составе вирусного генома можно легко определить с помощью обычного ДНК-гибридизационного теста. Можно также тестировать экспрессию чужеродного гена с помощью дот-анализа с антителами (см. разд. 2.5.3 и 2.5.4).
Было показано, что два цикла очистки через отдельные бляшки обеспечивают получение гомогенного вирусного препарата. В типичном эксперименте от 20 до 90% первоначально отобранных 77(--бляшек оказывалось рекомбинантами; остальные представители спонтанных 77(--мутантов. Отметим, что в тех случаях, когда клонировали очень большие фрагменты ДНК, доля рекомбинантов среди 77(--вирусов уменьшалась. По-види-мому, чем крупнее фрагмент чужеродной ДНК, заключенный между фланкирующими вирусными последовательностями, тем менее эффективно протекает гомологичная рекомбинация, обеспечивающая интеграцию этого фрагмента в вирусный геном.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
47 Т
2.5.3. Дот-гибридизация ДНК
1. Инфицируйте клетки 143 ТК~, выращенные в 1,5 см2 ячейках (1—2-105 клеток) половиной вирусного препарата, полученного из отдельной ТКг-бляшки (предполагаемый рекомбинант,, отобранный как описано в разд. 2.5.2).
2. Инкубируйте при 37 °С в течение 36—48 ч. Соскоблите инфицированные клетки в среду. Для этой цели удобно использовать поршень от шприца на 1 мл.
3. Нанесите пятую часть собранного материала на нитро-целлюлозный фильтр. Для этого профильтруйте материал через-ячейки прибора для нанесения дот-образцов типа «manifold», выпускаемого фирмой Schleicher and Schuell.
4. Промойте фильтр 100 мМ NaCl; 50 мМ трис-НС1 pH 7,5.
5. Поместите фильтр на 3 мин последовательно на листы Whatman ЗММ, пропитанные: а) 0,5 М NaOH; б) 1М трис-НСГ pH 7,0; в) 2XSSC (1XSSC:0,15 М NaCl; 0,015 М цитрат натрия).
6. Прогрейте фильтр в вакуумном шкафу при 80 °С в течение 2 ч. После этого фильтр можно гибридизовать с радиоактивно меченной пробой (ДНК интересующего гена), воспользовавшись рекомендациями, изложенными в [22]. Гибридизация с пробами, удельная активность которых составляет 107 имп/мин/мкг ДНК, позволяет получить отчетливый сигнал на рентгеновской пленке при экспонировании ее в течение ночи.
7. Методом отдельных бляшек проведите очистку тех препаратов вируса, которые дали положительный сигнал при гибридизации с интересующим геном. Приготовьте препараты рекомбинантных вирусов, как описано в разд. 2.3.3 (табл. 3 и 4).
На рис. 4, А показаны результаты эксперимента по дот-гиб-ридизационному анализу ДНК. В данном случае кДНК гликопротеина VSV (штамм New Jersey VSV NJ) была поставлена под контроль позднего промотора вируса (pLTPl, рис. 3), транс -лоцированного в вирусный ген tk. После трансфекции инфицированных вирусом клеток плазмидной рекомбинантной ДНК 7\К--вирусы были отобраны на клетках 143 ТК~ в присутствии-BUdR; всего отобрали 24 бляшки. Из каждой бляшки на небольшом монослое приготовили вирусный препарат и тестировали его с помощью меченной 32Р кДНК VSV на присутствие-ДНК VSV. Из 24 отобранных 77("бляшек 20 дали положительный гибридизационный сигнал с ДНК VSV (см. рис. 4Л).
2.5.4. Дот-анализ с применением антител
Для выявления рекомбинантных вирусов можно использовать антисыворотку к продукту клонированного гена. На рис. 4,Б представлены результаты эксперимента по иммунодетекции, проведенного параллельно с вышеописанным экспери-
Предыдущая << 1 .. 219 220 221 222 223 224 < 225 > 226 227 228 229 230 231 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed