Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Добавьте соответствующую среду (учитывая тип клеток и при необходимости— требования селекционной процедуры), содержащую 5% FCS. Инкубируйте при 37 °С, пока вирусный цитопатический эффект не проявите» у большинства клеток монослоя.
3. Соскоблите инфицированные клетки в среду и открутите на низкой скорости в настольной центрифуге.
4. Суспендируйте осадок клеток в 2 мл гипотонического буфера. Это может быть 10 мМ трис-НС1 pH 9; 1 мМ ЭДТА или же 5 мм цитрат-фос-фатный буфер pH 7,4.
5. Вскройте клетки путем трехкратного повторения цикла замораживания— оттаивания. Полученный вирусный препарат храните при —70 °С. Этот препарат при необходимости может быть использован для получения больших количеств вируса (предварительно такой препарат следует подвергнуть мягкой ультразвуковой обработке).
2.4. Методики трансфекции
После того как кодирующая белок последовательность чужеродного гена поставлена под контроль промотора вируса осповакцины и в составе рекомбинантной плазмиды фланкирована последовательностями вирусной ДНК, можно переходить к следующему этапу — введению данного гена в геном вируса путем гомологичной рекомбинации in vivo. Для трансфекции инфицированных вирусом осповакцины клеток CV1 используют каль-ций-фосфатный преципитат плазмидной ДНК аналогично тому, как это делается при работе с вирусными мутантами (метод «спасения» маркера) [13]. Трансфекцию проводят в тех же экспериментальных условиях. Мы также получали вирусные рекомбинанты путем трансфекции инфицированных первичных фибро-бластов куриных эмбрионов MRC5 и человеческих клеток 7/С~143. Процедура трансфекции описана в табл. 5. Полученный по этой методике вирусный препарат практически целиком представлен вирусом дикого типа, однако рекомбинация между диким вирусом и плазмидной конструкцией все же имеет место и позволяет получить ограниченное число рекомбинантов. В следующем разделе описана процедура выделения этих рекомбинантов.
При необходимости можно изменить некоторые параметры трансфекционной процедуры, с тем чтобы повысить эффективность рекомбинации (см. гл. 6 данного тома). В нескольких работах [14—16] сообщалось, что добавление вирусной ДНК к кальций-фосфатному преципитату увеличивает эффективность спасения маркера. Замена используемой в качестве носителя телячьей тимусной ДНК плазмидной рекомбинантной ДНК также повышает эффективность этой процедуры. Примечательно*
Таблица 4. Получение препаративных количеств вируса
А. Неочищенные препараты
1. Засейте восемь 150 см2 флаконов — каждый 5-107 клеток HeLa (суспензионная культура) в среде МЕМ. Инкубируйте в течение ночи.
2. Возьмите половину вирусного препарата, полученного по методике, изложенной в табл. 3, добавьте 0,1 объема раствора трипсина (2,5 мг/мл) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °С.
3. Разведите препарат до 16 мл PBS+0,1% BSA и по 2 мл внесите в каждый из флаконов. Инкубируйте при 37 °С в течение 1 ч, добавьте по 40 мл МЕМ+5% FCS и инкубируйте еще 48 ч.
4. Соберите клетки, для чего соскоблите их в среду^ и открутите на низкой скорости в настольной центрифуге. Ресуспендируйте осадок клеток в МЕМ, исходя из расчета 2 мл среды на один монослой (в сумме—16 мл), и проведите 3 цикла замораживания — оттаивания для высвобождения вируса.
5. Определите титр полученного вирусного препарата (табл. 1). Обычно такие препараты имеют титр 1010 б. о. е./мл.
Б. Очищенные препараты
1. Нарастите 2—10 литров суспензионной культуры клеток HeLa S3 до плотности 5-105 клеток/мл.
2. Инкубируйте необходимое количество неочищенного вирусного препарата в присутствии трипсина (0,1 объема раствора трипсина с концентрацией 2,5 мг/мл) при 37 °С в течение 30 мин. Количество вируса должно быть достаточным для заражения клеток в суспензии при множественности 5 б. о. е. на клетку.
3. Сконцентрируйте клетки до 5 - 10е клеток/мл путем низкоскоростного центрифугирования (ресуспендируйте в среде культивирования).
4. Добавьте к сконцентрированным клеткам трипсинизированный неочищенный препарат вируса и инкубируйте в суспензии при 37 °С в течение 1 ч. Разбавьте суспензию средой до концентрации 5-105 клеток/мл и инкубируйте еще в течение 48 ч.
5. Соберите инфицированные клетки и ресуспендируйте в 10 мМ трис-НС1 pH 9,0 при 4°С, исходя из расчета — 2 мл буфера на 2-107 инфицированных клеток из монослоя или на 100 мл суспензионной культуры. Эту и все последующие процедуры выполняйте на льду.
6. Гомогенизируйте в плотно пригнанном гомогенизаторе Даунса (15— 20 ходов поршня). Проконтролируйте полноту разрушения клеток под микроскопом.
7. Осадите ядра путем центрифугирования при 750 g в течение 5 мин при 4 °С. Ресуспендируйте осадок в 10 мМ трис-НС1 pH 9,0, снова центрифугируйте и жидкие фазы объедините.
8. Добавьте 0,1 объема трипсина (2,5 мг/мл) и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин с периодическим встряхиванием.
9. Наслоите этот препарат на равный объем 36% (по весу) сахарозы в 10 мМ трис-НС1 pH 9,0 в пробирке для ротора Beckman SW27 (Г-З.б") или эквивалентного. Центрифугируйте при 13 500 об/мин (25 000 г) в течение 80 мин при 4°С.
