Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
10. Удалите надосадочную жидг^сть и ресуспендируйте осадок (вирус и клеточные обломки) в 2 мл 1 мМ чрис-НО pH 9,0. Добавьте 0,1 объема трипсина (2,5 мг/мл) и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
11. Наслоите по 2 мл суспензии вируса на градиент концентрации сахарозы (15—40% в 1 мМ трис-НС1 pH 9,0) в пробирках для ротора SW27 (или эквивалентного). Центрифугируйте при 12 000 об/мин (18 750 g) в течение 45 мин при 4 °С.
12. Отберите зону, содержащую вирус, с помощью шприца и иглы (проколите стенку пробирки). Разведите в 3 раза 1 мМ трис-НС1 pH 9,0 и осадите вирус центрифугированием при 25 000 g в течение 60 мин при 4 °С.
474
Глава 7
Продолжение
13. Ресуспендируйте вирус в 1 мМ трис-НС1 pH 9,0, разделите препарат на аликвоты и храните при —70 °С.
14. Определите титр вируса в одной из аликвот, пользуясь методикой, описанной в табл. 1. 5 литров клеточной суспензии обычно дают 2 мл препарата с титром 5 • 1010 б. о. е./мл.
Таблица 5. Методика трансфекции для получения рекомбинантных
вирусов
1. Инфицируйте только что сформировавшуюся монослойную культуру CV1 (25 см2) очищенным вирусным препаратом (множественность —• 0,05 б.о.е. на клетку). Воспользуйтесь методикой, описанной в табл. 1 (стадии 1—5); на стадии 3 приготовьте требуемое разведение вируса.
2. Добавьте 1 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды к 19 мкг ДНК тимуса теленка в 1 мл HEPES-буфера (см. гл. 6 разд. 5.1).
3. Осадите ДНК, добавив хлорид кальция до концентрации 125 мМ. Оставьте при 25 °С на 30 мин.
4. Через 2 ч после инфицирования клеток удалите вирусный инокулят и дважды промойте монослой средой, не содержащей сыворотки. Добавьте
0,5 мл суспензии ДНК и инкубируйте при комнатной температуре.
5. Через 30 мин добавьте 5 мл среды +5% FCS и инкубируйте при 37 °С в течение еще 3,5 ч.
6. Замените среду на МЕМ+5% FCS.
7. По прошествии 48 ч после инфицирования соберите клетки, соскоблив их в среду. Выделите вирус путем трехкратного повторения цикла замораживания — оттаивания.
что ни глицериновый, ни диметилсульфоксидный шок не влияют на ее эффективность. Наряду с клетками CV1 мы использовали человеческие клетки TKi~ 143. По-видимому, большинство клеточных линий, восприимчивых к вирусу осповакцины и эффективно трансфицируемых кальций-фосфатным методом, могут с успехом заменить клетки CV1.
2.5. Селекция рекомбинантов
Выбор метода отбора рекомбинантов зависит от места внедрения чужеродного гена и от природы экспрессируемого продукта этого гена.
2.5.1. Селекция ТК+-рекомбинантов
Первое сообщение об экспрессии чужеродного гена в вирусе осповакцины касалось гена пиримидинкиназы вируса простого герпеса [6, 9]. В этом случае экспрессия клонированного гена сообщает рекомбинантному вирусу фенотип ТК+, что позволяет легко отличить его от исходного 77(--вируса. Рекомбинантные плазмиды, использовавшиеся для создания вирусных Т/С+-ре-комбинантов, содержали кодирующую последовательность пири-
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
475
Таблица 6. Получение и селекция 77<+-рекомбинантов
1. Инфицируйте клетки CV1 77<--мутантом вируса осповакцины при множественности 0,05 б. о. е. на клетку (см. табл. 1 стадии 1—5; на стадии 3 приготовьте требуемое разведение вируса).
2. Через 2 ч добавьте к клеткам кальций-фосфатный преципитат ДНК рекомбинантной плазмиды (см. табл. 5). Оставьте при 25 °С на 30 мин. Добавьте к клеткам среду, инкубируйте при 37 °С и через 48 ч после инфицирования выделите вирус (стадии 2—7 табл. 5).
3. Полученный вирусный препарат содержит небольшое количество П<+-рекомбинантов, которые можно отобрать, наращивая вирус в селективных условиях — на среде, содержащей метотрексат (аметоптерин). Высейте препарат вируса на клетки 143 ТКг, которые только что образовали полный монослой (стадии 1—2, табл. 2). Селективная верхняя агаризованная среда должна содержать 5% FCS. 100 мкМ незаменимых аминокислот, 15 мкМ глицина и 1 мкМ метотрексата.
4. Через 48 ч после инфицирования окрасьте клетки, чтобы визуализировать бляшки. Отберите бляшки, образованные ТК+ -вирусом, и очистите их методом отдельных бляшек на селективной среде, как описано в табл. 2 (стадии 4—7).
мидинкиназного гена вируса простого герпеса типа 1, состыкованную с промотором гена вируса осповакцины (кодирующего полипептид размером 7,5 кДа). Этот функциональный блок фланкировали последовательности ДНК, взятые из левой концевой части генома вируса осповакцины, которая не оказывает существенного влияния на процесс развития вируса. Методика, описанная в табл. 6, может оказаться полезной при создании рекомбинантов, экспрессирующих различные гены, пристыкованные к тиминкиназному гену вируса герпеса.
Некоторое время спустя было показано, что 7Д'+-вирусы действительно содержат в геноме интегрированный ген tk вируса герпеса и своим ГЛ^-фенотипом обязаны эффективной экспрессии этого гена. Теоретически была обоснована возможность вводить гены в 7/С_-вирус осповакцины в тандеме с геном тимидин-киназы. Преимуществом такого подхода является то, что все 7/С+-вирусы должны содержать также и интересующий ген. Недостатком же его следует считать необходимость создания сложных рекомбинантных конструкций, что сопряжено с целым рядом технических трудностей. Монослойные культуры человеческих клеток 143 ТКг очень быстро дегенерируют в присутствии метотрексата. Сохранность монослоя повышается, если вместо агара для верхнего слоя, содержащего метотрексат, использовать легкоплавкую агарозу. Мы задались вопросом, нельзя ли найти клетки, более устойчивые к метотрексату, и с этой целью опробовали мышиные линии ЬМТК~и ВНКТК~. В наших руках вирус осповакцины плохо развивался на клетках LMTK-, давая очень мелкие бляшки. Линия ВНКТК- в этом отношении была несколько лучше, однако и эти клетки не могли сравниться с ТК~ 143. Вот почему мы вернулись к линии ТК~ 143 и
