Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
к
3
X
О)
36 ОС
g I
/О В 3
§ О
X g
ё « S g.
«I
о-
с=
«I
РИС. 8-12.
Сравнение разделения с помощью тонкослойной хроматографии (Л) и хроматографии на бумаге (?) аденина (/), аденозина (2), гипоксантина (3), инозина (4) и уридина (5) в обоих случаях на целлюлозе при проявлении водой.
сорбента и промывания полученного порошка подходящим растворителем. Типичная тонкослойная хроматограмма показана на рис. 8-12.
Тонкослойная хроматография очень широко распространена, так как обладает рядом преимуществ перед хроматографией на бумаге и колоночной хроматографией, к числу которых следует отнести большую разрешающую способность, так как пятна здесь намного меньше, большую скорость разделения, более широкий выбор материалов для сорбентов, простое обнаружение пятен и легкость выделения веществ с хроматограмм.
Большую разрешающую способность тонкослойной хроматографии обеспечивают два фактора: во-первых, отношение массы растворенных веществ к массе сорбента составляет от 1 : 103 до
1 : 104, тогда как в колоночной хроматографии это отношение обычно равно 1 : 50; во-вторых, соотношение поверхность/объем очень велико, поскольку частицы сорбента могут быть очень мелкими (менее 0,1 мм), что позволяет для данного объема сорбента получить большую активную поверхность. Такие маленькие частицы не применяются в колоночной хроматографии, поскольку под действием силы тяжести они спрессовываются, что приводит к уменьшению скорости движения жидкости, а это крайне нежелательно, так как при очень малой скорости потока возрастает размывание зон за счет диффузии.
При хроматографии на бумаге применяют только целлюлозу и те немногие продукты, из которых можно получать бумагу.
Тонкослойная хроматография лишена этого недостатка. Кроме того, тонкослойная хроматография по сравнению с хроматографией на бумаге более быстрый процесс и дает лучшее разрешение. Волокнистая структура бумаги и связанные с этим капиллярные явления приводят к увеличению размера пятен. Материалы, используемые в тонкослойной хроматографии, можно измельчать с тем, чтобы устранить волокна. В случае меньших пятен время пробега можно уменьшить, так как для разделения пятен здесь требуется меньшее время. Зачастую тонкослойная хроматография требует всего лишь нескольких минут. Это является серьезным преимуществом в том случае, когда неизвестен оптимальный растворитель для разделения и в течение одного дня требуется проверить большое число систем растворителей.
Меньший размер пятен означает также, что концентрация вещества в пятнах больше; таким образом, для обнаружения требуется меньшее количество вещества. Действительно, для многих веществ тонкослойная хроматография является в 50—100 раз более чувствительным методом, чем хроматография на бумаге, причем можно обнаружить вещество в количестве до 1 нмоля. Обнаруживаемое количество аминокислот примерно в 10 раз меньше, чем в случае хроматографии на бумаге, что имеет большую ценность в случае, когда имеется лишь небольшое количество образца очищенного белка для проведения аминокислотного или пептидного анализа. Для тонкослойной хроматографии нуклеотидов требуется в 100 раз меньшее количество, чем для их хроматографии на бумаге.
Газожидкостная хроматография
До сих пор речь шла о распределительной хроматографии с жидкой подвижной фазой и жидкой неподвижной фазой, которая иммобилизована путем адсорбции на твердом носителе. В газожидкостной хроматографии (ГЖХ) подвижной фазой служит газ, а неподвижной фазой также является жидкость, которая либо нанесена на внутреннюю поверхность колонки (капиллярная колонка), либо на твердый носитель, например диатомовую землю, порошок тефлона или мелкие стеклянные шарики (насадочная колонка). Жидкая фаза для нанесения предварительно растворяется в летучем растворителе, таком, как эфир. Например, мелкие стеклянные шарики погружают в раствор полиэтиленгликоля в эфире и после того, как эфир улетучится, каждый шарик оказывается покрытым слоем полиэтиленгликоля. При температуре, которая обычно используется в газожидкостной хроматографии, полиэтиленгликоль плавится и остается на шариках в виде жидкой пленки. Образец, представляющий собой вещество, способ*
1 2
РИС. 8-13.
Схема аппарата для газожидкостной хроматографии.
/ — ввод образца; 2 —колонка; 3 — газ-носитель; 4 —детектор; 5 —термостат.
ное испаряться без разложения, вводят в жидком состоянии с инертным газом, например гелием, аргоном или азотом, и затем нагревают. Образующаяся газовая смесь проходит через колонку по схеме, показанной на рис. 8-13. Насадочные колонки обычно имеют диаметр около 0,5 см и длину от 1 до 20 м. Длина капиллярных колонок обычно колеблется в пределах от 30 до 100 м. Для достижения особенно хорошего разрешения применяются капиллярные колонки до 2 км в длину. Испаренные вещества постоянно перераспределяются между подвижной газовой фазой и неподвижной жидкой фазой в соответствии с их коэффициентами распределения, в результате чего и происходит хроматографирование. На конце колонки находится подходящий детектор.
