Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
3. Раствор калия-натрия виннокислого (сегнетовой соли) 50%-й. Приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
4. Реактив Несслера. Используют заводской реактив или приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
5. Образцовый раствор аммиачного азота: 0.3820 г перекристаллизованного NH4Cl помещают в мерную колбу на 1 дм", растворяют в небольшом количестве безаммиачной воды, доводят водой до метки, перемешивают. Приготовленный
341
раствор содержит 0,1 мг N-NH4 в 1 см". Рабочий раствор с содержанием 0,01 мг N-NH4 в 1мл получают разбавлением запасного раствора в 10 раз и используют для построения калибровочной шкалы. Шкала сохраняет свою окраску не более 1 ч. При более длительном стоянии растворы мутнеют.
Примечание. Дистиллированную воду необходимо проверить на содержание аммиака. Если вода дает положительную реакцию на присутствие аммиака, прибавляют химически чистую соду до слабощелочной реакции и упаривают раствор на 1/4 объема. Безаммиачную воду Хранят в бутыли с тубусом. Для улавливания аммиака в пробку бутыли вставляют трубку, заполненную NaHCO3.
Аспарагиназа (L-Аспарагин-амидогидролаза. КФ 3.5.1.1)
Аспарагиназа играет важную роль в азотном обмене и наряду с уреазой может отражать динамику азотсодержащих органических соединений в почве. Она катализирует гидролиз аспарагина, действуя на амидную связь. Аспарагин разлагается аспарагиназой на аспарагиновую кислоту и аммиак:
H2N-CO-CH2-CH(NH2)^COOH -» HOOOC-CH2-CH(NHZ)-COOH + NH3.
Метод определения аспарагиназной активности основан на учете количества аммиака, освобождающегося при гидролизе аспарагина в почве.
Ход анализа
Навеску почвы 5 г помещают в колбу на 50 см3, добавляют 10 см3 фосфатного буфера (pH 6,0), 5 CMJ 3% раствора аспарагина и 0,5 см3 толуола. Колбу ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч. Затем фильтруют. Дальнейшее определение ведут по той же схеме, как при определении активности уреазы почвы (окрашивание с реактивом Несслера).
Активность аспарагиназы выражают в миллиграммах N-NH4 на 10 г почвы за сутки.
Реактивы
1. 1 M раствор KCl: 74,5г хлористого калия растворяют в 1 дм" воды.
2. Раствор калия-натрия виннокислого (сегнетовой соли) 50%-й. Приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
Примечание. Дистиллированная вода не должна содержать аммиака. Загрязненную воду очищают так же, как при определении активности уреазы.
3. 3%-й раствор аспарагина: 3 г заводского аспарагина растворяют в 97 см" дистиллированной воды.
4. Фосфатный буфер с pH 6,0 готовят смешиванием 121 см" раствора А и 879 см" раствора Б. Раствор А - в 1 дм" дистиллированной воды растворяют 11,876 г Na1HPO4 12H2O: Раствор Б - в 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 9,078 г KH2PO4
5. Реактив Несслера.
342
ФОСФОГИДРОЛАЗЫ
Аденозинтрифосфатаза (А ТФ фосфогидролаза. КФ 3.6.1.3)
АТФаза катализирует гидролитическое расщепление АТФ на АДФ и ортофосфорную кислоту: АТФ ->АДФ + H3PO4
Метод основан на количественном учете фосфорной кислоты, отщепленной в результате ферментативной реакции при взаимодействии АТФ с почвой.
Ход анализа
На технических весах берут 1 г почвы в коническую колбу на 100 см". Прибавляют пипеткой 1 см" 0,02 M раствора АТФ-Na. Пипеткой приливают 2 см3 этаноламинацетатного буфера (pH 8,0 по индикаторной бумаге).
Примечание. Для определения активности АТФазы при pH почвы вместо буферного раствора добавляют дистиллированную воду.
Если анализируют ненасыщенные основаниями почвы, добавляют 1 CMJ 0,2 M раствора ЭДТА для маскировки мешающих ионов Al и Fe.
Колбу закрывают корковой пробкой, встряхивают и ставят в термостат при 3O0C на 1 ч. После инкубации в колбу добавляют 50 CMJ буферной смеси Труога, встряхивают на ротаторе 30 мин для экстрагирования фосфорной кислоты.
Фильтруют через беззольный фильтр. 10 см3 фильтрата переносят пипеткой в мерную колбу на 50 см". Прибавляют пипеткой 2 CMj сульфат-молибденовой жидкости, 3 капли хлористого олова, перемешивают, доводят до метки, перемешивают и через 20 мин колориметрируют с красным светофильтром (длина волны 650 нм).
Количественный учет фосфорной кислоты, отщепленной от АТФ под действием АТФазы, проводят по предварительно составленной калибровочной кривой.
Активность АТФазы (X) выражают в миллиграммах P2O5 на 100 г почвы
, v а ? р ? 100
за 1 ч: X= -^- ,
н
где а - количество P2O5 по калибровочному графику, мг; р - разведение; н - навеска, г; 100 - пересчет на 100 г почвы.
Реактивы
1. 0,02 M раствор АТФ-Na.
2. Этаноламинацетатный буфер с pH 8.0: 25 см" 0,2 M этаноламина + 50 см" 0.1 M CH3COOH + 25 см3 H2O).
3. ЭДТА: 0.1 M раствор этилендиаминтетраацетата.
4. Буферная смесь Труога: 3 г (NH4)2S04 и 20 см3 0.05 M H2SO4 растворяют в дистиллированной воде, доводят до 1 дм".
5. Сульфатмолибденовая жидкость. Приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
343
6. Раствор хлористого олова (восстановитель). Приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
7. Стандартный раствор фосфата: 0,1917 г перекристаллизованного и высушенного при 400C KH2PO4 растворяют в дистиллированной воде в колбе на 1 дм3. 1 см3 этого раствора содержит 0,1 мг P2O5.
Если к раствору прибавить антисептик (тимол, толуол, несколько капель уксусной, серной или 0,8 M борной кислот) и хранить в склянке из темного стекла, он годен к употреблению длительное время.
