Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
Активность аскорбинатоксидазы (X) выражают в миллиграммах дегидроаскорбиновой кислоты на 100 г почвы за 1 ч, учитывая, что количество аскорбиновой кислоты эквивалентно количеству образующейся дегидроаскорбиновой кислоты:
X = (а-б>'М р -100 н
где а - количество 0,001 M раствора 2,6-дихлорфенол-индофенола (синьки), израсходованное на титрование 1 см3 аскорбиновой кислоты, взятой в качестве субстрата, см3; б -в опытном варианте, см3; M - молярность 0,001 M раствора синьки с учетом поправки к титру; р - разведение раствора; н - навеска почвы, г; 100 - перевод на 100 г почвы.
Реактивы
0,001 M раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола: растворяют 200 мг краски в небольшом количестве воды, а затем доводят объем до 1 дм3. Раствор необходимо профильтровать, а затем для подщелачивания добавляют NaHCO3 (на кончике ножа). Титр краски по аскорбиновой кислоте определяют непосредственно перед опытом. Для этого в мерной колбе на 50 см" растворяют 1-1,5 мг (несколько кристаллов) аскорбиновой кислоты в 2%-й H2SO4. В две конические колбочки берут по 5 см" приготовленного раствора, и после добавления кристаллов йодистого калия KI (5-10 мг) и 5 капель 1%-го раствора крахмала, титруют в одной колбочке краской, в другой - точно 0,001 M раствором KIO3. Расчет титра: T= 0,088 ? а : Ь, где T- количество миллиграммов аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 см" краски; 0,088 - количество миллиграммов аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 см3 0,001 M раствора йодата калия; а - объем 0,001 M раствора йодата калия, израсходованный на титрование раствора аскорбиновой кислоты, см"; Ъ - количество раствора краски, израсходованное на титрование, см3.
328
Полифенолоксидаза (о-Дифенол: кислород-оксидоредуктаза. КФ 1.10.3.1.)
Полифенолоксидаза в почве участвует в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Катализирует окисление моно-, ди-, трифенолов до хинонов в присутствии кислорода воздуха. Хиноны при конденсации с аминокислотами и пептидами могут участвовать в образовании первичных молекул гуминовых кислот.
Активность полифенолоксидазы определяется по образованию пурпурогаллина из пирогаллола.
Ход анализа
Навеску почвы 1 г помещают в мерную колбу На 50 см3 с притертой пробкой. Прибавляют пипеткой 10 см" 1%-го раствора пирогаллола, перемешивают. Ставят в термостат при 300C на 30 мин. Образовавшийся в процессе инкубирования почвы с пирогаллолом в термостате пурпурогаллин извлекают серным эфиром (который добавляют в колбу до метки), закрывают пробкой, перемешивают. Через 10 мин колориметрируют эфирный раствор на фотометре Пульфриха в кюветах на 5 мм при длине волны 430 нм. В качестве стандарта используют раствор бихромата калия.
Активность полифенолоксидазы (X) выражают в миллиграммах пурпурогаллина, образовавшегося за 30 мин. в 100 г почвы.
X= а 100 н
где а - мг пурпурогаллина по калибровочному графику; н - навеска почвы, г; 100 - пересчет на 100 г почвы.
Реактивы
1. 20%-й раствор H2SO4: 129,9 см" концентрированной H2SO4 осторожно вливают в 500-800 см" воды, перемешивают и доводят объем до 1 дм".
2. Стандартный раствор бихромата калия: 0,75 г K2Cr2O7 растворяют в 1 дм3 0,5 M HCl (оптическая плотность этого раствора соответствует таковой раствора, содержащего 5 мг пурпурогаллина в 50 см3 эфира).
3. 0,5 M HCl: 41 см" концентрированной HCl (d = 1.19) вливают в дистиллированную воду, доводят до 1 дм3.
Пероксидаза (Донор: Н2ОгОксидоредуктаза. КФ 1.11.17)
Пероксидаза участвует в реакции конденсации веществ при образовании молекул гуминовых кислот, принимает участие в окислительно-восстановительных процессах в почве.
Этот фермент катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей, так как сами перекиси обладают сравнительно слабым окисляющим действием на фенолы.
Пероксидаза действует на фенолы и ароматические амины: пирогаллол, гидрохинон, пирокатехин, ортокрезол и др.
329
Оптимальное значение pH для активности пероксидазы лежит в пределах нейтрального и слабощелочного интервала, однако может несколько меняться в зависимости от характера субстратов.
Ход анализа
На технических весах берут навеску почвы 1 г в мерную колбу на 50 CMj с притертой пробкой. Прибавляют пипеткой 10 см3 \%-то раствора пирогаллола, 2 см3 0,5%-го раствора перекиси водорода, 0,5 см3 толуола. Колбу закрывают пробкой, встряхивают и ставят в термостат при температуре 300C на 30 мин, по истечении которых прекращают реакцию, прибавив 5 см3 2%-й H2SO4-
Образовавшийся пурпурогаллин извлекают многократным взбалтыванием смеси с серным эфиром в делительной воронке (до обесцвечивания раствора). Эфирные слои сливают в мерную колбу и доводят ее эфиром до метки; перемешивают и колориметрируют с зеленым светофильтром (430 нм) в кювете шириной 10 мм.
В качестве стандарта при колориметрировании применяют водный раствор двухромовокислого калия (0,75 г соли растворяют в 1 дм3 0,5 M HCl) или эфирный раствор кристаллического пурпурогаллина (5 мг пурпурогаллина в 50 см3 эфира).
В исследуемой вытяжке должно содержаться не менее 2 мг пурпурогаллина.
