Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
Принцип метода основан на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков путем связывания их в окрашенные комплексы.
Ход анализа
На технических весах берут навеску почвы 2 г в колбу Эрленмейера на 50 CMj. Приливают 10 см" 1% раствора желатина или казеина, приготовленного на фосфатном буфере (pH 7,4) и 0,5 см" толуола. Колбу закрывают корковой пробкой, взбалтывают на ротаторе 3 мин и ставят в термостат на 24 ч при температуре 30°С. По истечении времени содержимое колбы фильтруют.
Берут аликвоту 5 см" в стеклянную пробирку, добавляют пипеткой 0,5 CMj 0,05 M раствора Н2804.Приливают 3 CMj 20%-ГО раствора Na2SO4, который в слабокислой среде осаждает белки.
Еще раз фильтруют раствор в пробирку, прибавляют пипеткой 1 CMj 2%-го раствора нингидрина, взбалтывают.
Пробирку с раствором нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Окрашенный раствор из пробирки переносят в мерную колбу на 50 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают.
339
Колориметрируют на ФЭКе в кюветах шириной 5 мм, используя зеленый светофильтр (длина волны 540 нм).
Активность протеазы (X) выражают в миллиграммах глицина на 100 г:
х= а р-100 н
где а - количество глицина по калибровочному графику, мг; р - разведение; н - навеска почвы, г; 100- пересчет на 100 г почвы.
Построение калибровочной шкалы. Чистый глицин (0,1 г) растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. 1 см3 этого раствора содержит 1 мг глицина. Из основного раствора берут в мерные колбы на 50 см3 2, 4, 6, 8, 10 см3 раствора, добавляют все реактивы, как описано выше, окрашивают нингидрином.
Реактивы
1. 1%-й раствор желатина или казеина в фосфатном буфере (pH 7,4).
2. Фосфатный буфер (pH 7,4): готовят, смешивая растворы.
а) 11,876 г Na2HPO4 • 2H2O растворяют в 1 дм" дистиллированной воды.
б) 9,078 г KH2PO4 растворяют в 1 дм3 воды. Смешать 800 см3 раствора «а» и 200 см3 раствора «б».
3. 2%-й раствор нингидрина в ацетоне: 2 г нингидрина растворяют в 100 см3 ацетона. Перед окрашиванием смешивают 95 см3 ацетонового раствора нингидрина с 1 см3 CH3COOH и 4 см3 воды. Раствор нестойкий, готовится непосредственно перед употреблением.
4. 0,05 M раствор H2SO4.
5. Толуол.
Уреаза (Карбамид-амидогидролаза. КФ 3.5.1.5)
Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ:
CO(NH2) 2 -+2NH3 + CO2 + H2O
Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение. Она образуется и в самой почве в качестве продукта превращения азотистых органических соединений -белков и нуклеиновых кислот.
Ход анализ
В колбу Эрленмейера на 50 см" берут 5 г почвы, добавляют 10 см3 фосфатного буфера (pH 6,7), 10 CMj 10%-ГО раствора мочевины. Колбу закрывают ватной или корковой пробкой, встряхивают и ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч.
После инкубации содержимое колбы фильтруют в мерную колбу (объем колбы выбирают в зависимости от содержания аммония). Сначала на фильтр переносят только жидкость, затем в колбу добавляют 15 CMJ IM раствора KCl, 5 мин встряхивают на ротаторе для вытеснения из почвы поглощенного аммония и продолжают фильтрование, объем фильтрата доводят до метки.
340
Далее количественное определение аммония, образовавшегося под действием мочевины можно проводить несколькими методами.
? Определение количества аммония по Къелъдалю (полумикрометодом) и колориметрическим методом.
При определении по Кьельдалю аликвоту фильтрата (объем подбирают в зависимости от активности уреазы - 10-20 см") переносят в колбу для отгона аммиака (по Кьельдалю).
? Колориметрический метод учета аммония с реактивом Несслера.
Из мерной колбы отбирают пробу 1-5-10 CMj фильтрата (в зависимости от содержания аммиака) в мерную колбу на 50 CMj, добавляют примерно 30 CMj дистиллированной воды, перемешивают. Добавляют 2 см3 50%-го раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют 2 CMJ реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают.
Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 10 -20 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).
Примечание. Если раствор опалесцирует, прибавляют еще 2 см3 сегнетовой соли.
Разведение окрашенных растворов не допускается, поэтому если оптическая плотность раствора выше, чем предусмотрено калибровочным графиком, окрашивание повторяют, уменьшив аликвоту испытуемого раствора.
Количество аммония рассчитывают по предварительно составленному калибровочному графику.
Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N-NH4 на 10 г почвы
за сутки: X= '-Р'МО
н
где а — количество N-NH4 по графику, мг, н — навеска воздушно-сухой почвы, г; р — разведение; 100 - пересчет на 100 г почвы.
Реактивы
1. Фосфатный буфер с pH 6.7 готовят смешиванием 400 CMj раствора А и 600 см" раствора Б:
Раствор А: 11,876 г Na2HPO4 H2O растворяют в 1 дм" дистиллированной воды. Раствор Б: 9,078 г KH2PO4 растворяют в 1 дм' воды.
2. Раствор KCl 1 М. Приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ. Раствор не должен окрашиваться при добавлении фенолфталеина и реактива Несслера.
