Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов и в почве.
Активность окислительно-восстановительных ферментов находится в корреляционной зависимости с основными физико-химическими свойствами, микробиологическими процессами в почве, нитрификацией, сульфофикацией.
Катализа
(H2O2 : Н^гоксидоредуктаза. КФ 1.111.6)
Катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: 2 H2O2 —> 2 H2O + O2
Перекись водорода образуется в процессе дыхания растений и в результате биохимических реакций окисления органических веществ.
Роль каталазы в почве заключается в разрушении ядовитой для растений перекиси водорода.
Методы определения каталазной активности почв основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой.
325
Газометрический метод определения активности катализы
Ход анализа
Навеску почвы 1 г вносят в толстостенную колбу или склянку емкостью 100 CMj, добавляют 0,5 г CaCO3. Осторожно на дно колбы ставят пинцетом маленький стаканчик с 5 CMJ 3% раствора перекиси водорода (1). Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой, имеющей трубку, соединенную каучуковым шлангом через тройник (2), снабженный зажимом или краном, с бюреткой. Последняя сообщается с грушей (3). Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в бюретке (4) и груше уравновешивают и последнюю закрепляют на определенной высоте. Закрывают кран, устраняя сообщение прибора с внешней средой. Следят, чтобы уровень воды в бюретке не менялся, что свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе и комнате (рис. 24).
Начало опыта отмечают по
секундомеру в тот момент, когда стаканчик с перекисью водорода опрокидывается и вслед за этим встряхивается содержимое колбы. Взбалтывание смеси продолжают во все время опыта, не касаясь непосредственно колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой фиксируют.
Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают при температуре 18 - 200C в течение 1 - 2 мин.
Рис. 24. Прибор для определения активности каталазы:
I - колба с почвой и маленьким стаканчиком на дне; 2 - каучуковый шланг
и тройник; 3 - груша; 4 - бюретка
326
Активность каталазы выражают в миллилитрах кислорода, выделившегося на Ir почвы за определенный промежуток времени (1 мин).
Перманганатометрический метод определения активности каталазы Джонсона и Темпле
Ход анализа
В коническую колбу емкостью 125 см3 помещают 2 г почвы, приливают 40 см3 дистиллированной воды и 5 см3 0,3%-й H2O2. Колбу взбалтывают на ротаторе 20 мин. Нерасщепленную часть перекиси стабилизируют добавлением 5 CMj 1,5 M серной кислоты, содержимое фильтруют через плотный фильтр. Затем 25 CMj фильтрата титруют 0,1 M KMnO4 до слабо-розовой окраски. Точную начальную концентрацию использованной перекиси устанавливают титрованием перманганатом в кислой среде. Для этого 5 см3 0,3%-й перекиси смешивают с 40 см3 воды и 5 см3 1,5 M серной кислоты и 25 см3 этой смеси титруют 0,1 M марганцевокислым калием.
Из количества перманганата, израсходованного на титрование исходной перекиси водорода (А), вычитают количество перманганата, израсходованного для титрования аликвоты фильтрата (Б). Эта разница с учетом поправки к титру перманганата (T) отражает каталазную активность почвы, определяемую по формуле: (А- Б) ? Т.
Каталазную активность выражают в см3 0,1 M KMnO4 на 1 г почвы за 20 мин.
Реактивы:
1. 0.3%-я перекись водорода: 30%-й раствор разбавляют водой в соотношении 1:100:
2. 1.5 M серная кислота;
3. 0,1 M раствор перманганата калия, титр которого устанавливают по оксалату натрия.
? Описание метода взято из монографии Ф.Х. Хазиева «Методы почвенной энзимологии» (M., Наука, 1990).
А скорбинатоксидаза (L-аскорбинат : кислород-оксидоредуктаза. КФ 1.10.3.3)
Этот фермент катализирует окисление аскорбиновой кислоты. Источником аскорбиновой кислоты в почве могут быть микроорганизмы и растения. Под действием аскорбинатоксидазы она превращается в дегидроаскорбиновую кислоту.
В основе метода лежит использование редуцирующих свойств аскорбиновой кислоты. Определение активности сводится к установлению остаточного количества аскорбиновой кислоты после взаимодействия почвы с субстратом. Разность между количеством аскорбиновой
327
кислоты, внесенной в почву, и оставшейся неиспользованной после инкубирования с почвой эквивалентна количеству образующейся де-гидроаскорбиновой кислоты.
Ход анализа
Навеску почвы 1 г помещают в колбу Эрленмейера на 50 см3. Приливают пипеткой 1 см" 1%-го раствора аскорбиновой кислоты и 1 см3 дистиллированной воды. Колбу встряхивают, закрывают корковой пробкой и ставят на 1 ч в политермостат при температуре 37°С. После инкубации добавляют 28 см3 1%-й HCl. Взбалтывают на ротаторе 5 мин и фильтруют через рыхлый фильтр.
В колбы Эрленмейера на 250 см3 помещают пипеткой 5 см3 фильтрата, приливают 45 CMj дистиллированной воды и титруют 0,001 M раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (синька) до розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.
