Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Селекция трансформантов в агаре. К числу признаков, которые могут быть селективными при введении в клетки онкогенных последовательностей, относится признак независимого от субстрата размножения. В связи с этим после переноса онкогенов, через 36 ч, первичные эмбриональные фибробласты снимают смесью версена с трипсином и клонируют в полужидком агаре.
Приготовление полужидких агаровых сред для выявления трансформантов по признаку не зависимого от субстрата размножения. Го-товится 1.2 %-ный агар фирмы «Difco», лучше типа Noble на деионизированной воде. Навеску агара оставляют на ночь в воде для набухания. Автоклавирование производится в течение 1 ч при 1 атм. В горячем виде агар разливается по 25 мл в стерильные 50 мл флаконы, в которых готовится 0.6 %-ный агар для нижнего (питательный слой) и верхнего 0.3 %-ного агарового слоя, в котором собственно культивируют клетки. Нижний слой готовится из 1.2 %-ного агара (разогретого в кипящей водяной бане и затем охлажденного в ультратермостате до 44 °С) добавлением 20 см3 2-кратной среды Дальбекко и 5 См3 фетальной сыворотки. Нижний слой формируется из 0.6 %-ного агара по 5 мл на 60 мм чашку Петри, после чего чашки ставятся в СОг-инкубатор до затвердевания агара. После того как нижний слой приготовлен, клетки снимают смесью трипсина с версе-ном и подсчитывают в камере Горяева. Для получения верхнего слоя из 0.3 %-ного агара необходимый объем культуральной среды
с 10 % фетальной сыворотки и клетками смешивается в соотношении 1:1с 0.6 %-ным агаром, так чтобы общее число клеток на чашку составляло 104—105, а объем верхнего слоя был равен 1.5 мл. Видимые глазом колонии появляются через 14—18 сут после посева. В течение этого срока культивирования можно добавлять по 0.5—1 мл ростовой среды с 10 % сыворотки. Колонии из агара выделяют с помощью пастеровских пипеток и помещают в ростовую среду либо на 24-ячеечную плату, либо на 30 мм чашки Петри. После размножения клеток доказывается наличие в них онкогенных последовательностей, которыми была проведена трансформация, затем клоны используются для экспериментальной работы.
Трансформация эмбриональных фибробластов крысы двумя онкогенами. При введении двух онкогенов в первичные эмбриональные фибробласты крысы возможен отбор трансформантов по «фокусам» морфологической трансформации без введения доминантных маркеров устойчивости. Процедура получения морфологических трансформантов при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК такая же, как описано выше. Смесь двух плазмид, которыми трансформируют первичные эмбриональные фибробласты, растворяют в буфере Б и формируют преципитат, которым обрабатывают клетки. Суммарное количество ДНК на 60 мм чашку, в которой находится 3 • 105 клеток, не должно превышать 20 мкг. Через сутки клетки рассевают и, меняя каждые 3 сут среду, ожидают появление «фокусов» морфологической трансформации, которые формируются через 18—21 сут после обработки клеток преципитатом плазмидной ДНК- Затем «фокусы» выделяют с помощью титановых цилиндров и после размножения клеток определяют гибридизацией по Саузерну присутствие двух онкогенных последовательностей, вводимых в составе различных плазмидных векторов. Выделенные трансформантные клоны можно использовать для изучения различных аспектов канцерогенеза (in vitro и in vivo).
Литература
1. McCann J., Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagenes in Salmonella / mi-crosome tests: Assays of 300 chemicals // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976. Vol. 73. P. 950—954.
2. Bischop M. Cellular transforming genes // Annu. Rev. Biochem. 1983. Vol. 52. P. 301—354.
3. Graham F. L., van der Eb A. J. A new technique for the assay of inefectivity of human acienovirus 5 DNA // Virology. 1973. Vol. 52. P. 456—471.
4. Jainchill J. L., Aaronson S. A., Todaro G. J. Murine sarcoma leukemia viruses: assay using clonal lines of contact inhibited mouse cells // J. Virol. 1969. Vol. 4. P. 549— 553.
5. Land H., Parada L. F., Weinberg R. A. Cellular oncogenes and multistep carcinogenesis // Nature. 1983. Vol. 222. P. 771—778.
6. Глебов О. К-, Абрамян Д. С., Томилин Н. В. Генетическая трансформация соматических клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка, дефектных по тимидиикииазе, отличающийся высокой эффективностью трансформации // Цитология. 1985. Т. 27. № 4. С. 467—475.
7. Gorman С. High efficiency gene transfer into mammalian cells. DNA cloning ,// 1RL Press Limited. 1985. Vol. 2. P. 143—165.
8. Takahashi М., Ritz J., Cooper G. M. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement // Cell. 1985. Vol. 42, P. 581—588.
9. Diamond A., Cooper G. М., Ritz J., Lane A. Identification and molecular cloning of the human B-lym transforming gene activated in Burkitt’s lymphomas // Nature.
1983. Vol. 305. P. 112—116.
10. Lane M. A., Sainten A., Doherty К. М., Cooper G. M. Isolation and'characterization of a stage specific transforming gene T-lym 1 from T-cells lymphomas // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2227—2231.
11. Schechter A. L., Stern D. F., Vaidyanatan L. et al. The new oncogene: an erb-B-related gene encoding a 185 000-Mr tumor antigen // Nature. 1984. Vol. 312. P. 513—516.
