Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
12. Cooper C. S., Park М., Blair D. G. et al., Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line // Nature. 1984. Vol. 311. P. 29—
33.
13. Cooper G. M. Cellular transforming genes // Science. 1982. Vol. 217. P. 801—806.
14. Armelin H. A., Armelin М. C. S., Kelley K. et al. Functional role for c-myc in mytoge-nic response to platelet-derived growth factor // Nature. 1984. Vol. 310. P. 655—660.
15. Adams J. М., Harris A. W., Pinkert C. A. et al. The c-myc oncogen driver by immuno-globuline enchancers induces lymphoid malignancy in transgenic mice//Nature. 1985. Vol. 318. P. 533—538.
16. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. М., 1976. 221 с.
17. Perucho М., Hanachau D., Wigler М. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells // Cell. 1980. Vol. 22. P. 309—317.
18. Mulligan R. C., Berg P. Selection for animal cell that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 2072—2076.
19. Southern P. Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV-40 early region promotor // J. Moi. Appl. Genet. 1982. Vol. 1. P. 327—341.
Ч а с т ь 4
Культивирование клеток f*
разного происхождения .•
Культивирование каллусных тканей
на твердых питательных средах
В. В. Урман цева
Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Москва ¦
Культура изолированных органов, тканей и клеток растений в настоящее время находит все большее применение в биологических исследованиях. Такие методы, как клональное микроразмножение растений, оздоровление от вирусной инфекции с помощью культуры апикальных меристем, регенерация растений из каллусных культур, находят сейчас практическое применение. Существенную помощь методы культивирования in vitro могут оказать генетикам и селекционерам в получении новых форм растений. Используя гаплоиды, незрелые или нежизнеспособные зародыши гибридов, сомаклональные варианты растений-регенерантов, биотехнологи вместе с селекционерами ускоряют и облегчают селекционный процесс. Более сложная техника манипулирования с клетками растений необходима для получения соматических гибридов слиянием протопластов или для генетической трансформации клеток и растений.
Для большинства названных исследований необходимым звеном является получение и культивирование каллусных тканей на твердых питательных средах. В отечественной литературе этой теме посвящен ряд книг и методических пособий [1—3]. Наша задача более узкая — рассмотреть применяемые в настоящее время приемы, методы и технологии, в том числе и относящиеся к рациональной организации лаборатории.
Самым важным обстоятельством при получении и выращивании клеточных культур является необходимость асептики. В соответствии с этим мы выделяем особо все методы асептического получения исходных эксплантатов и дальнейших манипуляций с ними в условиях, обеспечивающих стерильность.
Технологическая линия
Наиболее рациональным является отделение лабораторных помещений для работы со стерильными культурами от тех, в которых проводится обычная аналитическая работа с тканями. При наличии большого объема работ необходимо предусмотреть хорошую увязку всех помещений, входящих в технологическую цепочку: мытье и сушка посуды-*-приготовление среды-^автоклавирование и стерили-
зация материалов сухим жаром-»-пересадка растительного мате-риала-*-выращивание культур. Рекомендуется иметь тележки для транспортировки материалов из одного помещения в другое.
Мытье и сушку посуды проводят в моечной комнате, оборудованной глубокими кислотоупорными раковинами для мытья посуды, моечными машинами, дистилляторами, сушильными шкафами. Над раковинами необходимо поставить вытяжки. Грязную посуду освобождают от остатков агаровой среды, тщательно отмывают водой с помощью ершика, затем моют с применением детергента или хромовой смеси, ополаскивают 10—15 раз водопроводной и 1—2 раза дистиллированной водой. Сушить посуду следует 1—2 ч в сушильных шкафах при 120—140 °С. При наличии в средах инфекции микроорганизмы убивают автоклавированием.
Рекомендуется иметь отдельную комнату для приготовления питательных сред, оборудованную шкафами для чистой посуды и реактивов, столами с большой рабочей поверхностью, холодильниками для хранения концентратов сред, морозильниками для хранения при —20 °С и ниже, техническими и аналитическими весами, рН-метрами, электроплитками, водяными банями.
Стерилизацию питательных сред и материалов проводят в специальной комнате, оснащенной автоклавами и сухожарными стерилизаторами или сушильными шкафами с контактными термометрами. Питательные среды автоклавируются при давлении 0.7—0.8 атм (117 °С) в течение 15—30 мин в зависимости от объема среды. Пустые колбы, закрытые пробками или фольгой, дистиллированная вода в колбах, вата, марля, пачки бумаги стерилизуются 1 ч при давлении
