Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2 атм (121 °С). Металлические инструменты, колбы, стаканы, чашки Петри, завернутые в плотную бумагу, стерилизуются сухим жаром при 140 °С — 2 ч, при 180 °С — 30 мин.
Все работы, связанные с асептическим переносом растительного материала, проводятся в стерильных боксах. В боксах устанавливаются бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 мин за 1 ч до работы. Кроме того, рекомендуется ночью проводить автоматическое облучение боксов в течение 2 ч. В последние годы получили широкое распространение ламинарные боксы — установки обеспыливания с горизонтальным или вертикальным потоками воздуха (УО-БГ, УО-БВ, Ужгород). При наличии нескольких установок их рекомендуется поместить в отдельной комнате, где необходимо поддерживать чистоту, еженедельно проводить влажную уборку дезинфицирующими растворами и облучать помещение ночью ультрафиолетовыми лампами.
Выращивание каллусных культур проводится в темноте при температуре 26 °С± 1 °С и влажности воздуха 70 %. Для выращивания используют кондиционированные комнаты, оборудованные стеллажами, шкафы или климатические камеры (КВ-1Р или КВ-1Л, Ужго-_ род).
Представленный вариант оснащения лаборатории рекомендуется при большом объеме работ. При более узких задачах можно совмещать работы и сокращать число специализированных помещений.
Основная среда, мг/л
Компоненты среды Г амборга Мураснге и Нича и Шенка и Уайта [8]
и Эвелега Скуга [5] Нич [6] Хнльде-
В5 [4] брандта
[7]
nh4no3 М а к р о с зли
1650 720
(nh4)2so4 134 --- --- --- _ ^
nh4h2po4 --- --- --- 300 ---
kno3 2500 1900 950 2500 80
кн2ро4 --- 170 68 __ _
KCI --- --- --- --- 65. s
Ca(N03)2 безвод --- --- --- --- 208.50 .
ный 150 440 166 200 _ !
CaCI2 • 2H20
MgSO* • 7H20 250 370 185 400 360 ¦;
Na2S04 --- --- --- _ 200
NaH2P04 . 2H20 169.6 --- --- --- 18.7 ,
М икроэлементы 1
MnS04•4H20 13.2 22.3 25.0 13.2 7.0 ‘
H3BO3 3.0 6.2 10.0 5.0 1.5 >
ZnS04•7H20 2.0 8.6 10.0 1.0 3.0 ,
ki 0.75 0.83 --- 1.0 0.75 >.
CuS04 • 5H20 0.025 0.025 0.025 0.2 0.001 J
Na2Mo04 • 2H20 0.25 0.25 0.25 0.1 0.0025 *
CoC12 • 6H20 0.025 0.025 --- 0.1 --- 1
FeS04 • 7H20 28.0 Железе 27.8 ”15.0 1 ^
27.8
Ыа2-ЭДТА •' 2H20 37.3 37.3 37.3 20.0 _ ’
Fe2(S04)3 --- --- --- 2.5
О р г а нические добавки
Мезоииозит 100.0 100.0 100.0 1000.0 _
Фолиевая кислота --- --- 0.5 _ _ ¦'
Никотиновая 1.0 0.50 5.0 5.0 0.5
кислота 10.0 0.10 0.5 5.0 f
Тиамин HCI 0.1
Пиридоксин НС1 1.0 0.5 0.5 0.5 0.1
Глицин --- 2.0 2.0 ---1 3.0
Бнотин --- --- 0.05 --- --- (
2.4Д 2.0 ФиТОГОр! Л 0 н ы 0.5 м
ч
_ ' г
И УК --- - 2.0 0.1 0.1 _
Кинетин --- 0.2 --- --- --- ч
Компоненты среды Основная среда, мг/л
Г амборга Мурасиге и Ннча н Шенка и Уайта [8]
и Эвелега Скуга [5] Ннч [6] Хильде-
В5 [4] бракдта
[7]
Углеводы
Сахароза | 20 000 | 30 000 | 20 000 | 30 000 | 20 000
Субстрат
Агар-агар | 7000 | 8000 | 7000 | 6000 j 7000
Приготовление питательной среды
Составление питательной среды [4—8] начинают с приготовления концентрированных растворов (табл. 1). Макросоли взвешивают на технических весах, растворяют по отдельности в небольшом количестве бидистиллята и доводят в цилиндре до объема, в 10 раз меньшего, чем требуется по прописи среды (хранят при 4 °С до 1 мес), т. е. на 1 л общего объема питательной среды берут 100 мл раствора макросолей. Навески микроэлементов растворяют так, чтобы конечная концентрация соответствовала 1 мл раствора на 1 л среды. Навески микросолей для хелатного железа взвешивают, растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 5 мл/л (хранят при 4 °С несколько месяцев). Раствор должен получиться ярко-желтого цвета, pH 8.0. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция или магния.
