Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Наиболее трудной задачей является получение стерильного растительного материала. Вид стерилизующего агента, его концентрацию и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани эксплантата. Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяют химические соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия — Г— 1.4%, гипохлорит кальция — 7—10%, хлорамин — 2—10%) или ртуть (сулема 0.1 %, диацид), перекись водорода (2—10 %), этиловый спирт (96 или 70 %) и др. Эффективность стерилизации повышается при добавлении на 1 л стерилизующего агента 5—6 капель Твин-80 или Твин-20.
Начиная работу с новым растительным объектом, необходимо предварительно найти удовлетворительные условия для его стерилизации.
Рекомендуется испробовать несколько вариантов, значительно различающихся между собой по времени стерилизации, а затем, сужая эти интервалы, найти условия, оптимальные для данного объекта (табл. 2).
В тех случаях, когда инфицирование культуры связано с наличием спор грибов или бактерий во внутренних полостях ткани, эксплантаты высаживают на среду, содержащую антибиотик широкого спектра действия (тетрациклин, доксициллин и др.) в концентрации 0.1—0.01 мг/л.
Техника стерилизации растительного материала. Перед стерилизацией объекты должны быть тщательно вымыты теплой водой с мылом и промыты дистиллированной водой. Сильно загрязненные корнеплоды после мытья рекомендуется выдерживать в слабом (розовом) растворе КМп04- Сегменты корней, стеблей, побегов, клубней опускают на несколько секунд в спирт, затем в стерилизующий
Таблица 2 Время стерилизации различных растительных объектов
Время стерилизации, мин
Ч.
Орган растения
гипохлорит натрия нли сулема кальция
d
Семена
Стебли древесных растений Стебли травянистых растений Мясистые корни, клубни Корневища Листовые пластинки Верхушечные и пазушные почки Ткани репродуктивных органов
20
15—30
10—15
20—25
20—30
3—5
10—15
3—5
10—20
20—30
15—20
20
5
3—15
1—5
8—10
раствор. Через 20—25 мин сегменты переносят в стакан со стерильной дистиллированной водой, выдерживают 10 мин, затем меняют воду еще 2 раза, выдерживая в каждой порции по 15—20 мин. В стерильных чашках Петри или на листах стерильной бумаги обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. Из стеблевой паренхимы табака или корнеплодов после обрезания кончиков сегментов стерильным пробкобуром выделяют цилиндрики ткани, которые затем нарезают скальпелем на диски и помещают на агаризованную среду.
При стерилизации мелких объектов (семян, почек и др.) их помещают в марлевые мешочки, затянутые длинной ниткой, и в них проводят последовательно через операции стерилизации и промывки стерильной водой. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.
Семена до набухания стерилизуют для снятия эпифитной и субэпидермальной микрофлоры одним из стерилизующих агентов, трижды промывают стерильной водой и оставляют для набухания в стерильной чашке Петри. Затем семена стерилизуют второй раз, отмывают 3 раза стерильной водой и с помощью стерильных инструментов вычленяют зародыш или его структуры, которые помещают на питательные среды для роста зародыша или индукции каллусов, кроме того, стерильные семена можно использовать для получения каллуса из семян, помещенных на агаризованную среду, содержащую фитогормоны, а также для получения проростков из семян на агаризованной среде без фитогормонов, с последующим использованием стерильных корней, побегов, листьев в качестве эксплантатов для получения каллусных культур. При помещении кусочков или дисков стебля на питательную среду требуется соблюдать условия физиологической полярности, т. е. помещать их апикальным концом в среду. У фрагментов пластинок листа надсекают в нескольких местах жилки и помещают их нижней стороной пластинки на среду.
Эксплантаты приводят в плотный контакт со средой, но не погружают.
Все операции по стерилизации исходного растительного материала проводятся в стерильном боксе или ламинар-боксе. ,
