Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
аммония (pH 4,1) и определяют количество десорбированного цитохрама,
измеряя оптическую плотность при 280 нм. После каждого определения гель
следует отмыть 0,5 М едкого натра, а затем_ дистиллированной водой до
нейтрального pH. Отмытый гель лиофильно высушивают и взвешивают.
В синтетических полимерах, например оксиалкилметакрилатных гелях типа
сферона, неспецифическая сорбция может быть обусловлена остающимся
неэлюированным органическим растворителем, который использовался при
приготовлении сорбента.
Адсорбционную емкость можно определить также другим способом. Раствор
сывороточного альбумина в 0,05 М ацетате натрня делят на две равные
части. Одну часть наносят на колонку с испытуемым гелем, уравновешенным
тем же буфером. После пропускания через колонку фракции, содержащие
белок, объединяют н доводят до определенного объема 0,05 М раствором
ацетата натрия. Вторую часть раствора альбумина, которая служит в
качестве контрольной, доводят до того же объема. Совпадение значений
оптической плотности обоих растворов при 280 нм показывает, что
неспецифическая сорбция на геле не имеет места. В случае сферона, если
сравниваемые растворы не обнаруживают одинакового поглощения, гель
следует промыть органическими растворителями, разбавленной кислотой, а
затем тщательно дистиллированной водой.
Гели с неспецифической сорбцией не следует использовать для аффинной
хроматографии.
9.1.2. Определение остаточных отрицательно заряженных групп [56]
Около 5 г влажного геля промывают на стеклянном фильтре сначала водой, а
потом 25 мл 1 М соляной кислоты. Гель после этого отмывают
дистиллированной аодой до нейтральных pH или отрицательной реакции на
хлориды (с нитратом серебра). Навеску геля затем суспендируют в 5 мл 2 М
раствора хлорида калия и титруют раствором 0,01 М едкого натра.
238
Глава 9
9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВИРУЕМЫХ И АКТИВНЫХ ГРУПП
9.2.1. Определение карбоксильных, гидразидных
и аминных групп кислотно-основным титрованием [37]
9.2.1.1. Определения в расчете на массу сухого образца
Для лучшей воспроизводимости следует относить количество функциональных
групп к массе сухого образна геля. Инман [37]
рекомендует следующую методику.
Образец на взвешенном стеклянном фильтре промывают с отсасыванием 0,2 М
соляной кислотой (для карбоксильных групп) или 0,2 М раствором карбоната
иатрия (для аминогрупп), чтобы перевести титруемые труппы в незаряженную
форму. Далее его тщательно промывают дистиллированной водой для полного
удаления электролита, а затем - метиловым спиртом для удаления воды.
Образец вместе со стеклянным фильтром высушивают в вакууме над безводным
хлоридом кальция. Взвешивание следует производить сразу же после того,
как фильтр с образцом вынут из эксикатора. Например] полиакриламид
увеличивает свою массу на ~2% в I ч в результате адсорбции влаги воздуха.
9.2.1.2. Определение карбоксилатных групп [37]
Промытый образец геля суспендируют в 0,2 М растворе хлорида натрия; обший
объем суспензии должен быть приблизительно равен двум объемам набухшего
геля. pH суспензии доводят до 6,5 - 7,5 с помощью разбавленного раствора
едкого натра. Затем при перемешивании магнитной мешалкой титруют
раствором соляной кислоты известной концентрации до pH 2,6. Содержание
карбоксильных групп в образце определяют по разности между числом милли-
эквивалентов добавленной НС1 и свободных Н+ (0,0025 V). Содержание
карбоксильных групп относят к массе сухого образца.
9.2.1.3. Определение гидразидных групп
р/Са ацилгилразидных групп близки к 2,6, и поэтому определение их
содержания путем прямого титрования очень затруднительно. Эти группы
лучше перевести в сукцинилгидразидные, добавив избыток янтарного
ангидрида (0,6 г яа 25 мл суспензии) при pH 4,0. Модифицированный гель
промывают 0,2 М раствором хлорида натрия и содержание карбоксильных групп
определяют по методике, приведенной в разд. 9.2.1.2. Величина плотности
гидразидных групп D, полученная из последующего определения сухого веса,
относится к сукцинилгид-разидному производному с учетом увеличения массы
на массу сукцинильных групп. Плотность групп в миллимолях гидразида иа 1
г исходного полиакриламида равна D'=0/(1 - 0,115 D).
9.2.1.4. Определение алифатических аминогрупп
Титруемый гель промывают и суспендируют в 0,2 М растворе хлорида калия;
объем раствора не должен быть больше удвоенного объема набухшего Геля. pH
суспензии доводят до 11,0 разбавленным раствором едкого кали. Суспензию
титруют раствором соляной кислоты (о) с известной молярностью М, доводя
pH до 7 (или при определении а-аминогрупп до pH 6). Затем измеряют объем
суспензии (V). Содержание аминогрупп рассчитывают из миллиэквивален-
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
239
тов НС1, пошедших на титрование (oAf) после вычитания миллиэквивалентов
титруемых свободных ОН-. Плотность групп в исходном полиакриламиде D' по-
, лучают исходя из плотности в расчете иа массу высушенного образца
производного, используя выражение D'=D/(1- ПДг). Величина Дг может быть
