Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
объемов 50%-ного спирта; агарозу затем удаляют центрифугированием при
2000 g в течение 10 мин. Измеряют оптическую плотность супернатанта при
750 нм относительно контрольного образца (готовят из немодифицироваиной
агарозы идентичным образом). Если содержание ЗЗ'-Диаминоднпропиламнна
определяют по графику, построенному для растворов свободного 3,3'-диамин
одипропил амина, следует вносить поправку, поскольку свободный 3,3'-
диаминодипропяламин имеет две первичные аминогруппы, а связанный с
сефарозой - одну.
9.3.8. Определение иммобилизованных белков по содержанию триптофана [17]
Эскамани и др. [17] применили метод определения триптофана, основанный на
взаимодействии с нингидрином в кислоте [27], к определению белков,
связанных с нерастворимыми носителями.
К свободному или иммобилизованному ферменту в 1 мл воды или разбавленного
0,02 М буфера добавляют по 1 мл иингидринового реагента (250 мг
нингидрина в смеси 6 мл 90%-ной муравьиной кислоты и 4 мл конц. НС1).
Приготовленные таким образом смеси в закрытых колпачками пробирках
инкубируют в водяной бане при IOO °С в течение 20 мин, охлаждают и
отбирают из каждой пробирки по 1 мл; пробы разбавляют 9 мл 95%-ного
спирта.
Определяют оптическую плотность полученных растворов при 400 нм
относительно контрольного образца (готовят из того же количества
нерастворимого носителя без фермента). Поскольку коллаген не содержит
триптофана, этот метод может быть использован для определения содержания
белков, ковалейгио связанных с коллагеном. Таким образом построен
калибровочный график для лактозы и глюкоам-илазы в присутствии коллагена
(рнс. 9.2).
Другим колориметрическим методом определения белков является метод Лоури
и др. [49]. Хейвкес и др. [31] применили его
250
Глава 9
к определению глутаматдегидрогеназы, связанной с сефарозой, причем
реакционная смесь перемешивалась в течение 20 мин и перед измерением
оптической плотности фильтровалась.
Рис. 9.2. Определение триптофансодержащего белка в присутствии коллагена
[17J.
Стандартный раствор лактазы был приготовлен растворением 100 мг
лиофнлизованной jj-галактозкдазы в 10 мл 0,02 М фосфатного буфера (pH
7,0). Стандартный раствор глюко-амнлазы был приготовлен подобным образом
в 0,02 М ацетатном буфере (pH 4,0). Аликвоты разбавлялись до 1,0 мл тем
же буфером н к каждому раствору добавлялось по 21,0 мг коллагеновой
пленки. К пробам и контрольному раствору коллагена добавлялось по I мл
нингидрннового реагента и растворы инкубировали 20 мие! б водяной бане
при 100 °С, После охлаждения аликвоты по 1 мл разбавлялись 9 мл 95%-ного
спирта к измерялась оптическая плотность при 400 нм относительно раствора
коллагена. / - лактаза, 2 - глюкоамнлаэа, Прямые рассчитаны по методу
наименьших квадратов с учетом всех точек, за исклЕОчени-ем двух
наибольших значений для глюкоамилазы.
9.4. ТИТРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕИНАЗ
После связывания ферментов с нерастворимыми носителями их свойства могут
меняться либо под влиянием микроокружения, либо в результате изменений,
вызванных химической модификацией благодаря образованию новых ковалентных
связей. Следовательно, очень полезно охарактеризовать фермент не только
определением общей ферментативной активности и количества связанного
белка, но и путем титрования активных центров.
Титрование активного центра трипсина, разработанное Чейзом и Шоу [11],
основано на специфической стехиометрической реакции трипсина с
субстратоподобным реагентом "-нитрофенил-"'-гуанидинобензоатом (НФГБ).
Реакция дает относительно стабильный ацилированный фермент с
одновременным "выбросом" "-нитрофенола. Количество определяемого
спектрофотометрически "-нитрофенола в "выбросе" пропорционально
количеству активного фермента. Этот метод был использован Фритцем и др.
[24] и Кнайтсом и Лайтом [40] для определения активного трипсина после
его ковалентного связывания с носителем. На рис. 9.3 показана схема
циркуляционной системы титрования, описанной Фордом и др. [23] для
титрования активных центров трипсина, ковалентно связанного со стеклом.
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
251
Объем раствора в системе доведен до 5-6 мл путем использования небольшого
(~1 мл) резервуара. Реактор, удаленный из системы, содержит только
образец--около 50 мг тщательно промытого иммобилизованного фермента.
Остальную систему заполняют 0,03 мМ раствором НФГБ (свежеприготовленным;
3 мМ НФГБ в днметнлсульфоксиде разбавляют 50 мМ вероналовым буфером, pH
8,3). Содержимое перекачивают со скоростью 10 мл/мии. Регистри* рующий
прибор спектрофотометра выставляют на нуль при длине волны 410 нм в
диапазоне 0,1 ед. оптической плотности и записывают медленный рост
поглощения, обусловленный спонтанным гидролизом.
Иммобилизованный щермет
Резервуар
Проточная
хтета.
Рис. 9.3. Циркулирующая система титрования [23].
Перед титрованием активных центров останавливают иасос, вводят в систему
реактор, содержащий фермент, включают насос с медленной скоростью,
