Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
метод
-SH 9-13 - 8.2.4
-SH Широкий диапазон условии -s-s -f\ N"' - 8.2.4
-SH -О 4,5-6,0 -соон Карбодиимид 8.2.4, 8.3
-с/ NH Щелочной раствор -nh2 - 8.2.3
агарозе после активации бромцианом или с помощью глутарового альдегида в
кислой среде). В этих случаях необходимо в обычную методику внести
соответствующие изменения. Когда реакция присоединения закончена, следует
блокировать непрореагировавшие группы (разд. 8.4).
При использовании для связывания бифункциональных реагентов следует
помнить о -возможных осложнениях, возникающих в результате сшивания и
носителя, и белков, а также их друг с другом, поэтому во время связывания
следует тщательно поддерживать необходимые условия реакции (pH,
температуру и продолжительность реакции).
Для связывания белков наиболее часто используют такие группы молекулы
белка, как N-концевая а-аминогруппа и е-ами-ногруппа лизина, а также С-
концевая карбоксильная группа и карбоксильные группы глутаминовой и
аспарагиновой кислот. Фенольные гидроксильные группы тирозина или SH-
группы остатков цистеина могут также принимать участие в связывании. В
углеводах и их производных чаще всего в связывании принимают участие
гидроксильные и аминогруппы, в нуклеиновых кислотах- фосфатные группы,
гидроксильные группы сахара и ами-яо- или енольные группы оснований.
Высокомолекулярные соединения, которые обладают большим числом групп,
способных связываться, присоединяются несколькими участками. Вследствие
этого значительно уменьшается риск отщепления связанной молекулы, однако
многоточечное связывание может приводить к деформации нативной структуры
иммобилизованной молекулы и ;таким образом изменять ее свойства. Иногда
применяют методы 1более лабильного связывания, например через
тиолсложноэфир-
232
Глава 8
ную связь между тиольными производными нерастворимых носителей и
молекулами, содержащими карбоксильные группы и наоборот. Такие связи
могут быть специфически расщеплены гидро-ксиламином, который приводит к
отделению интактного комплекса аффинного лиганда и вещества, подлежащего
выделению с матрицы.
С точки зрения легкости отщепления связывание белков через S - S-mocthkh,
по-видимому, имеет преимущества главным образом при получении
иммобилизованных ферментов. Инактивированные молекулы фермента можно
удалить путе.м восстановления " носитель использовать после активации для
связывания нового активного фермента. Поскольку относительно мало
ферментов содержат свободные SH-группы, последние можно ввести в молекулу
тиолированием (разд. 8.2.4). В противоположность этому для сорбентов,
приготовленных из стабильных низкомолекулярных соединений,
предпочтительнее использовать прочные связи (например, связывание с
эпоксиактивированными гелями), потому что их активность может быть
регенерирована промывкой с денатурирующими реагентами, такими, как 6 М
гуанидинхлорид (разд. 10.3). Прочная связь образуется также между
альдегидами и аминогруппами, если шиффово основание стабилизировать
восстановлением борогидридом натрия. Присоединение аффинных лигандов к
носителям, которые содержат активные сложноэфирные группы, также ведет к
прочной связи. Однако при этом образуются также свободные карбоксильные
группы, влияние которых необходимо исключить, что достигается повышением
ионной силы раствора при аффинной хроматографии. К недостаткам
специфических сорбентов, приготовленных азосочетанием, относится их
невысокая стабильность, требуемая для иммобилизованных белков [57].
Причина низкой стабильности заключается, вероятно, в том, что связь
образуется не только с фенольным и имидазоль-ным кольцами остатков
тирозина и гистидина, но также и с а-концевой и е-аминогруппами. Эти
побочные реакции приводят к образованию триазеновых -связей (-N=N - NH-),
которые менее стабильны и легко гидролизуются. Аффинные лиганды,
связанные азосвязью, можно освободить с помощью дитионита натрия,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ахёп R., Ernback S., Eur. J. Biochem., 18, 351-360 (1971).
2. Axen R-, Porath J., Ernback S., Nature (London), 214, 1302-1304
(1967).
3. Barry S., Griffin T" O'Carra P., Biochem. Soc. Trans., 2, 1319-
1322 (1974).
4. Barry S., O'Carra P., Biochem. J., 135, 595-607 (1973).
5. Brandt J., Andersson L. O., Porath J-, Biochim. Biophys. Acta, 386,
196-202 (1975).
6. Brocklehurst K., Carlsson /" Riersian M. P. J., Crook E. AL, Biochem.
J., 133, 573-584 (1973).
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
233
7. Campbell D. Н., Luescher Е. L., Lerman L. S., Proc. Nat. Acad. Sci.
U.S., 37, 575-578 (1951).
8. Carlsson J., Axin R., Unge Т., Eur. J. Biochem., 59, 567-572 (1975).
'9. Coupek J. Krivakovd М., Pokorny S., /. Polym. Sci, Symp., 42, 185-190
(1973).
10. Coupek J,, Labsky J., Kdlal J., Turkovd Valentova 0., Biochim.
Biophys. Acta, 481, 289-296 (1977).
11. Crook E. M.j Brocklehurst K., Wharton C. W., Methods Enzymol., 19,
963- 978 (1970).
12. Cuatrecasas P., J. Biol. Chem,, 245, 3059-3065 (1970).
