Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 99

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 198 >> Следующая

25 мл 10 об,%-ного водного-пиридина.
Голлеман и Вайс [35] после кислотного гидролиза определили на
аминокислотном анализаторе также е-аминокапроновую кислоту, элюируемую
непосредственно перед лизином. Свенсон [65] определил содержание
модифицированных е-аминогрупп по разности между количеством свободных
аминогрупп перед и после модификации. Свободные аминогруппы были
определены восстановительным метилированием растворами формальдегида и
борогид-рида. Образующиеся N-е-диметиллизин и N-e-метиллизин были затем
определены на аминокислотном анализаторе [54].
9.3.4.2. Определение нуклеотидов
Содержание нуклеотидов, связанных с сефарозой, рассчитывают, исходя из
содержания растворимого продукта, образующегося после щелочного или
нуклеазного гидролиза [32]. Поглощающий в УФ-области материал,
образующийся в супернатанте в результате гидролиза, определяют, измеряя
оптическую плотность раствора, гидролиз останавливают, когда оптическая
плотность перестает возрастать.
248
Глава 9
Для щелочного гидролиза I мл модифицированного геля смешивают с 1 мл 0,6
М едкого натра, смесь инкубируют при 37 °С. Для ферментативного гидролиза
рибонуклеазой Т2 смешивают 0,5 мл модифицированного геля с 0,5 мл 0,1 М
Na-ацетатиого буфера (pH 4,6), содержащего I ед. рибонуклеазы Т2.
Инкубацию также проводят при 37 °С. Ферментативный гидролиз
фосфодиэстера-зой проводят в 0,1 М трис-НС1-буфере (pH 8,5), содержащем
0,01 М хлорида магния. 1 мг фосфодиэстеразы яда змеи обрабатывают 0,5 мл
модифицированного геля. Берглунд и Экштейн f7] использовали и
фосфодиэкстеразу, и щелочную фосфатазу для гидролиза сефарозы с
присоединенными к ней л-аминофенил-АТР или л-аминофенил-dATP, определяя
нуклеотид в гидролнзате. Подобным образом после ферментативного гидролиза
щелочной фосфатазой определялось содержание иммобилизованного АМР
анализом фосфата, отщепляющегося от конца молекулы АМР [13].
Исходя из общего содержания фосфора [39], Моудгил и Тофт [52] рассчитали
количество АТР, связанного с сефарозой. Образец вначале окисляют 7%-ной
хлорной кислотой в 4,5 М серной кислоте, а затем инкубируют при 240 °С в
течение 60 мин..
9.3.4.3. Определение углеиода
Хожейши и Коцоурек [36] предложили следующую методику' определения
содержания углеводов в сополимерах.
0,1 г сухого порошка геля гидролизуют кипячением с обратным холодильником
в 2,5 М серной кислоте в течение 6 ч. После охлаждения содержание
углеводов в супернатанте определяют фенолсеркокислотным методом по Дюбуа
и Др. [16].
Галактозилпирофосфат, связанный с сефарозой, определяли анализом фосфатов
после гидролиза 0,5 М соляной кислотой при 100°С в течение 1 ч [4].
Подобным образом иммобилизованный N-ацетилглкжозамин определяли по
содержанию освобождающегося глюкозамина после кислотного гидролиза 6 М
соляной кислотой при 110°С [4].
После гидролиза модифицированного образца гепарин -г- сефарозы содержание
гепарина установлено по результатам определения сульфатов [62].
4),3.5. Определение количества связанного аффинного лиганда элементным
анализом
Содержание иммобилизованных нуклеозидов наиболее часто рассчитывают,
исходя из общего содержания фосфора [33, 44, 66], методики определения
которого описаны в работах [5, 39, 51].
Сульфаниламид, связанный с сефарозой, можно определить анализом
содержания серы [20].
Расчет содержания иммобилизованных аффинных лигандов по анализу азота
иногда приводит к ошибкам. Как уже обсуждалось в разд. 8.2.4, в ходе
активации бромцианом в гель вводится азот; количество последнего зависит
от температуры, при которой проводится активация [53]. Однако содержание
иммобилизованных белков, в особенности антител, часто рассчитывают по
азоту, определяемому методом Кьельдаля [50].
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
249
9.3.6. Определение меченых аффинных лигандов
Во многих случаях для связывания с нерастворимыми носителями
использовались аффинные лиганды, меченные радиоактивными изотопами.
Связанный аффинный лиганд легко определяется на основе измерения
радиоактивности. Например, Грин и Соме [30] определили таким образом
количество биотина, связанного с сефарозой.
По 0,1 мл суспензии отбирают с помощью силнконизированного
туберкулинового шприца на 0,25 мл или питетки Эппендорфа И наносят в
центр мишени площадью 4 см. К каждому образцу добавляют 0,05 мл 1%-ного
додецилсуль-фата натрия. Образцы сушат и измеряют радиоактивность.
Контрольные эксперименты с известным количеством [|4С]-биотина,
связанного с авндии-сефарозой, показали, что поправка иа самопотлощенне
составляет ^11%.
9.3.7. Колориметрическое определение иммобилизованного диаминопропиламина
с иингидрином [35]
0,1 мл аминоалкилагарозы разбавляют до 2 мл водой и добавляют 5 мл
раствора нннгидрина (4 мг нингидрииа растворяют в 150 мл метилцеллозольва
и 50 мл 4 н. ацетатного буфера, pH 5,5, и добавляют 80 мг SnCl2 в токе
азота). Смесь нагревают 20 мин на кипящей водяной бане, добавляют 7
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed