Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
аминогрупп [21]
Флуорескамин - очень чувствительный флуорогенный реагент,
, способный почти мгновенно реагировать с первичными аминосо-единениями;
при этом образуются флуорофоры, характеризующиеся максимумами поглощения
и излучения соответственно при 390 и 475 нм. Реагент позволяет обнаружить
пикомольные количества первичных аминов, он реагирует с незамещенными
аминогруппами нерастворимого носителя в мягких условиях с образованием
силь- * но флуоресцирующих производных:
5-10 мг анализируемого геля переносят на стеклянный фильтр и промывают
дихлорметаном, спиртом, снова дихлорметаном и хлороформом (каждым
растворителем три раза). Гель затем обрабатывают 10%-ным триметиламнном в
хлороформе, промывают хлороформом, спиртом и снова хлороформом (каждым
растворителем четыре раза но 1 мл). После фильтрования с отсасыванием
гель насыщают несколькими каплями 10%-ного триэтиламииа в хлороформе.
Затем добавляют раствор флуорескамика (10 мг/мл). Трнэтиламин должен
присутствовать в геле перед добавлением флуорескамина для предотвращения
превращения производного геля, содержащего флуорофор, в нефлуоресцнрующий
у-лак-тон. Подготовленный раствор оставляют на 10 мин при комнаткой
температуре, Затем гель фильтруют с отсасыванием и промывают хлороформом,
метанолом и снова хлороформом.
Воронку, содержащую гель, облучают ближним ультрафиолетовым светом <366
нм) и сравнивают флуоресценцию с контрольным образцом. Если замещение
близко к полному, интенсивность флуоресценции очень низка и близка к
контрольной. Результаты воспроизводятся с раствором флуорескамина,
который хранился I месяц при 4°С.
9.2.7. Определение оксирановых групп [63]
Для определения содержания оксирановых групп в растворе и в геле агарозы
используют реакцию между оксирановым кольцом и тиосульфатом натрия
СН-рнг + 2NO* + $г03*~ + ЦаО ------------> -сн-СНа-5гОэ- + 2Nlo+ + ОН-
У ли
242
Глава 9
Выделяющуюся щелочь титруют 0,1 М соляной кислотой на рН-стате. Для
определения оксирановых групп в растворе Санберг и Порат [63] рекомендуют
следующую методику.
50 мкл раствора, содержащего оке и рапы, добавляют к 1,5 мл 1,3 М.
тиосульфата натрия и поддерживают соляной кислотой постоянное значение pH
до окончания реакции. Содержание оксирана в растворе рассчитывают, исходя
из объема соляной кислоты, пошедшей ка поддержание нейтрального pH.
Для определения оксирановых групп в геле агарозы рекомендуется следующая
методика.
0,5 г влажной агарозы добавляют к 1,5 мл 1,3 М тиосульфата натрия (pH
7,0) и содержание оксирана в геле определяют титрованием соляной
кислотой. Гель агарозы подсушивают, отсасывая на воронке со стеклянным
фильтром в течение 5 мин, и взвешивают.
9.2.8. Определение емкости эфирных п-нитрофенильных производных
оксиалкилметакрилатных гелей (НФОМ) [67]
Количество активных групп определяют спектрофотометрически по
освобождению "-нитрофенола.
100 мг геля НФОМ суспендируют в 10 мл разбавленного (1: 1) аммиака и
суспензию оставляют иа 1-4 ч при периодическом перемешивании. Добавляют
90 мл дистиллированной воды и измеряют оптическую плотность прн 400 нм,
содержание n-иитрофенола определяют по калибровочному графику.
9.2.9. Определение степени замещения бензилированной сефарозы, сшитой
дибромпропанолом [43]
После исчерпывающего сульфирования бензилированной и не-бензилированной
сефарозы можно найти степень ее замещения по разности содержания серы в
том и другом препарате.
75 мл пиридина добавляют по каплям к 10 мл трехокиси серы в круглодонной
колбе, снабженной мешалкой и обратным холодильником и охлаждаемой баней
со льдом. К 7,5 мл полученной суспензии пиридинового комплекса трехокиси
серы в пробирке прибавляют 5 г тщательно промытого пиридином геля,
пробирку закрывают пробкой н оставляют на 24 ч при 40 "С. Сульфированные
гели затем промывают на стеклянном фильтре спиртом, водой, 1 М уксусной
кислотой, содержащей 2 М хлористый натрий, 1 М карбонатом натрия,
содержащим 2 М хлористый натрий, и, наконец, опять водой (по 200 мл
каждого промывного раствора). Гели лиофильно высушивают и анализируют на
содержание серы.
9.2.10. Определение винильных групп [96]
Определение основано на реакции
R-SOj.-Ch^CHj, + SjiOj2' +НгО-* R-SO.-CHj.-CHj-SjOf' + ОН *
2 мл 3 М тиосульфата натрия добавляют к 2 мл сшитого геля (в воде).
Гндрокснл-иоиы, образующиеся в результате реакции, титруют ОД М. соляной
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
243
кислотой; титрование заканчивают при pH 5,5; это значение pH имеет 1,5 М
тиосульфат натрия. Скорость реакции очень мала, н реакция заканчивается
за ~ 10-15 ч.
9.2.11. Определение сульфгкдрильных групп [47]
Сульфгидрильные группы, связанные с гелем, можно определить с помощью
реагента Элмана [5,5'-дитиобис-(2-нитробензвй-ная кислота)], при
взаимодействии с которым на каждую тиольную группу освобождается 1
молекула интенсивно окрашенного 5-сульфидо-2-нитробензоата:
"ООС СОСГ СОО- СОО"
Содержание последнего определяют, измеряя оптическую плотность при 412 нм
