Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
пространственной доступности участков связывания. Для низкомолекулярных
аффинных лигандов в особенности необходимо ввести пространственные группы
между этими лигандами и поверхностью матрицы. Природе этих
пространственных групп уже уделено много внимания.
Гидрофобные свойства первых использованных пространственных групп
послужили причиной возникновения нового типа хроматографии, а именно
гидрофобной хроматографии, которая далее развивалась как самостоятельный
метод, В этом методе важную роль играет гидрофобная пространственная
группа. Однако если в аффинной хроматографии делаются попытки
использовать преимущественно специфические взаимодействия участков
связывания, например фермента и ингибитора, то предпочтение отдается
пространственным группам гидрофильного характера. Поскольку роль аффинной
хроматографии в исследованиях специфических взаимодействий и механизма
действия биологически активных веществ возрастает, в настоящее время
обязательным является соответствие взаимодействия изучаемого вещества с
им?мо0илизо-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
229
ванным аффинным лигандом таковому в растворе, В этих случаях желательно
исключить влияние и природы носителя, и процесса иммобилизации. Однако
иммобилизация позволяет изучить влияние микроокружения. Очень часто новое
окружение благоприятно влияет на свойства иммобилизованного вещества.
Среди многих изменений свойств первым следует отметить повышение
устойчивости некоторых иммобилизованных ферментов. Зависимость
устойчивости от типа связывания и природы носителя показанаВитоллом и
Месоном [84]. Был приготовлен ряд иммобилизованных папаи-нов, связанных
различным образом со стеклом, и определялось время, в течение которого
активность препаратов уменьшается наполовину. Если папаин связан с
аминопроизводным стекла с помощью карбодиимида, время половинной потери
активности в рабочем режиме составляет 1,9 сут, а для иммобилизации при
помощи глутарового альдегида оно равно 2,2 сут; фермент, связанный с
карбоксильным производным стекла через амидную связь, имеет время
половинной потери активности 4,1 сут, связанный с ариламинным производным
стекла -7,2 сут, а со стеклом, покрытым двуокисью циркония, связанный
амидной связью имеет самое высокое время -35 сут.
Из вышеизложенного следует, что кроме природы нерастворимого носителя
существенную роль играет также метод связывания. В табл. 8.12 дан обзор
методов связывания, рассмотренных в разд. 8.2 и 8.3. При выборе методов
связывания главное внимание уделяется тому, какие группы аффинного
лиганда можно использовать для присоединения к нерастворимой матрице без
затрагивания связывающих участков аффинных лигандов. Если доступно
несколько групп, рекомендуется выбрать наиболее избирательный метод,
потому что желательна специфическая связь через одну определенную
функциональную группу. Присоединение не должно приводить к появлению в
специфическом сорбенте неспецифически сорбирующих групп. Поэтому лучше
привязывать к аффинному лиганду пространственную группу и только
модифицированный таким образом лиганд присоединять к нерастворимому
носителю. В результате образования связи между поверхностью
нерастворимого носителя и аффинным лигандом не должно возникать ни в
носителе, ни в аффинном лиганде неспецифически сорбирующих групп; эта
связь должна быть устойчивой в ходе сорбции, десорбции и регенерации (см,
разд. 8.5). При выборе метода необходимо принимать во внимание также
зависимость устойчивости аффинного лиганда от pH. Кислые протеина-зы,
например, нельзя связывать в щелочных средах, поскольку они будут при
этом инактивироваться. Поэтому в табл. 8.12 приводится также значение pH,
при котором проводится связывание. Однако во многих методах могут быть
получены хорошие результаты даже при низких pH (связывание в нейтральной
среде на
Таблица 8.12
Обзор методов связывания, включенных в гл. 8
Группа на аффинном лнгакде pH реакции связывания Группа на
нерастворимой матрице Активирующий реагент Раздел, где упоминается
метод
-NH. -НЙ -NHj -NHj -NHj -NHj 7.5-8 4.5-6,0 8,7 8,5 8 8-10 (можно >6) 8.5-
13 -CO-NH-NH, -соон -ОН -он -он -ОН NaN02 + HC1 Карбодинмид 2-Амнно-
4,6-дихлор-смлш-триазин Бромацетил Окисление Nal04 BrCN 8.2.1, 8.2.6
8.2.1, 8.3 8.2.1 8,2.1 8.2.3 8.2.4
-NH, -сн->сме - 8.2.4
* -NH, 5-10 хо-сн, -с-о-< 1 || N:o-ch, - 8.2.4
-NH, 8-10 -он Бензохинон 8.2.4
-NH, 7-5 -сн-сн- o=-c^i=o - 8.2.5
-NH, 8-5 CIsC = S 8.2.6, 8.2.8
-NH, 7,7 -NH, Глутаровын альдегид 8.2.6
-NH, 9-12 • - CO-Q-^~^-NO, - 8,2.7
-COOH -CO OH -OH 4.5-6 4.5-6 Щелочной раствор -NH, -SH -NH, Карбодинмид
" Окисление NalO* 8.2,8, 8.3 8.2,4, 8.3 8.2.1
-OH 9-13 -CH - HC, Y - 8.2.4
-^-OH 7,5-8,5 "CHf0~NH* NaNOi + НС1 8.2.1, 8.2.2, 8.2.6
Нерастворимые носители и методы иммобилизации Лиганда
231
Продолжение табл. 8.12 -
Группа ни аффинном лнганде pH реакции связывания Группа ка
нерастворимой матрице Активирующий реагент Раздел, где упоминается
