Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
(е=1,36-104 л - моль-1 ¦ см-1, pH 8). Метод использован для определения
SH-групп в производных сефарозы [14] и дигидролипоевой кислоты,
ковалентно связанной с сефарозой [47].
Для определения можно использовать также реакцию с 4,4'-ди-
пиридилдисульфидом [29] или 2,2'-дипиридилдисульфидом (^тах = = 324 нм,
е=1,98*104 л моль-1-см-1) [64]:
4,4'- дипиридиядцсу/тьфцд Ь-пиридинтио/т
Тиолы, связанные с сефарозой, можно определять, исходя из их способности
включать [14С]иодацетамид; для этого модифицированная сефароза
обрабатывается 0,01 М иодацетамидом в 0,1 М бикарбонате натрия {pH 8,0)
при комнатной температуре в течение 15 мин [14].
9.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ АФФИННЫХ ЛИГАНДОВ
В разд. 5.3 детально обсуждалось влияние концентрации иммобилизованных
аффинных лигандов. Очевидно, что после присоединения аффинного лиганда к
инертному носителе перед сорбцией очень полезно определить долю молекул,
ковалентно присоединившихся к матрице. Подготовленный аффинный гель не
должен содержать реакционноспособных групп (о блокировании остаю-
16*
244
Глава 9
щихся активных групп см. разд. 8.3); его следует тщательно про-мыть.
Приготовление гелей для практического применения рассмотрено в разд.
10.8, там же изложены методы для проверки того, что молекулы аффинного
лиганда, ковалентно связанные с нерастворимым носителем,- единственные,
присутствующие в геле.
9.3.1. Дифференциальный анализ
Содержание связанного с гелем аффинного лиганда можно определить по
разности между общим количеством добавленного к реакционной смеси
аффинного лиганда и выделенного в результате исчерпывающих промывок.
Несмотря на то что такой метод иногда используется, он дает неточные
результаты, особенно если ковалентно присоединяется небольшая доля
добавленного лиганда или если аффинный лиганд плохо растворим и требуются
большие объемы для отмывания несвязавшегося вещества. Однако метод ч
пригоден для приблизительной оценки количества присоединившегося лиганда.
Например, количество связанной ДНК определялось по разности оптической
плотности при 260 нм исходного вводимого раствора ДНК и конечного
промывного раствора [58].
9.3.2. Спектрофотометрические методы
Иммобилизованные аффинные лиганды, которые поглощают свет при >260 нм,
можно определять, спектрофотометрируя непосредственно модифицированные
гели. Гель суспендируют в оптически чистом полиакриламиде, этиленгликоле
или глицерине и определяют оптическую плотность в кюветах толщиной 1 мм
относительно немодифицированного геля в двулучевом спектрофотометре. Лоу
и др. [48] таким образом определили при 206 нм содержание
иммобилизованного NAD+. Содержание иммобилизованного NADH определялось
при 340 нм, а иммобилизованного FAD -при 450 нм [47]. Иммобилизованные
NADH, FAD и пиридоксамин флуоресцируют при облучении светом подходящей
длины волны [12,47].
При определении лейцинаминопептидазы и трипсина, ковалентно связанных С
сефарозой, Келын и др. [41] сопоставили пять методов определения
связанных белков: 1) основанный на балансе белка перед и после
связывания; 2) аминокислотный анализ после кислотного гидролиза; 3)
модифицированный метод Лоури; 4) спектрофотометрический и 5)
флуориметрический. Преимущество двух последних методов, которые они
исследовали детально, состоит в том, что эти методы не приводят к
разрушению геля. Как и метод Лоури, они характеризуются простотой, низким
пределом обнаружения и высокой воспроизводимостью.
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
245
Для солюбилизации модифицированных агароз предложено несколько методов,
позволяющих количественно спектрофотометриро-вать иммобилизованные
аффинные лиганды [47]. Гели агарозы могут быть растворены в горячей воде,
немодифицированная агароза растворяется при 60 °С, При последующем
охлаждении высококонцентрированных водных растворов агарозы получаются
непрозрачные растворы, в то время как более разбавленные растворы
становятся вязкими, но остаются прозрачными. Эти эффекты не зависят
Рис. 9.1. Спектры солюбилизированной агарозы [19].
0,2 мл суспензии агарозы растворялись при 2-часовом нагревании до 75 "С в
5,0 мл растворителя: я -НЮ UK 0,1 н. NaOH-1-0,1%-ный NaBH, (2); 50%-ная
СНзСООН (3); 0.1 н, HCI (4): 0,1-1 н. NaOH (перед записью спектра
доводили объем до 10.0 мл I н. NaOH) (5); б-50% пая СНзСООН (/); 0.1 н.
НС1 (2): 0,1 - 1 п. NaOH (перед 'записью спектра объев доводили до 10 мл
1 н. NaOH (5).
от pH во всем диапазоне. Напротив, модифицированные гели не растворяются
даже при нагревании до 75 °С в 8 М мочевине или 6 М гуанидинхлориде. Они
могут быть солюбилизированы при нагревании с 0,1 М соляной кислотой или
едким натром при 75 °С или, что используется наиболее часто, в 50%-ной
уксусной кислоте. После солюбилизации не образуется никакого заметного
осадка даже при доведении pH до нейтрального.
Спектры солюбилизированной агарозы показаны на рис. 9.1 [19]. Агароза,
будучи растворена в воде, прозрачна для всех длин волн >350 нм, но слегка
