Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Необходимость достижения столь высоких величин иногда ограничивает
использование аффинантов со слишком низкими Kl- Число промывок и объем
каждой промывки являются решающими для удаления загрязнений, и поэтому
стадия промывки сильно влияет на фактор очистки. При Z(l<10"4 моль/л
потери незначительны, даже когда промывка проводится большими объемами.
Теория аффинной хроматографии
35
Для элюирования раствором ингибитора наиболее важным параметром является
отношение равновесных констант Ki/Kl'. чем меньше это отношение, тем ниже
может быть концентрация растворимого ингибитора, необходимая для
элюирования.
Основные соотношения, полученные для одноразового метода аффинной
хроматографии, применимы также и для колоночной хроматографии.
Список используемых обозначений
А - параметр, определяемый уравнением (3.5)
В - параметр, определяемый уравнением (3.4)
[Е] - равновесная концентрация фермента Eh-кажущаяся концентрация
фермента (фермента, связанного с лигандом и включенного в гель) после
промывки перед элюированием [см. уравнение (3.24)]
Ео - начальная концентрация фермента в фазе раствора перед контактом с
фазой геля [ELI -равновесная концентрация комплекса фермент - лиганд
/ве - фракция фермента (отнесенная к его исходному количеству),
остающаяся связанной с лигандом после п промывок и одного элюирования
fan-фракция фермента (отнесенная к его исходному количеству), остающаяся
связанной с лигандом после п промывок
fn - фракция фермента (отнесенная к его исходному количеству) ,
теряющаяся в отбрасываемых после п промывок объемах w
fo - фракция фермента (отнесенная к исходному количеству), теряющаяся с
отбрасываемым объемом V fn - фракция фермента (отнесенная к исходному
количеству), содержащаяся в объеме V' после п промывок и одного
элюирования fn(m) - фракция фермента (отнесенная к исходному количеству),
содержащаяся в объеме V элюата после m стадий элюирования и п промывок /0
- исходная концентрация ингибитора
Kl-константа равновесия взаимодействия лиганд - фермент на стадиях
сорбции [определяется уравнением
(3.2)]
KL - константа равновесия лиганд - фермент в ходе элюирования
Ki - константа равновесия диссоциации комплекса фермент- растворимый
ингибитор
3*
36
Глава 3
ki -константа скорости комплексообразования фермента с лигандом
k-i-константа скорости диссоциации комплекса фермент--лиганд
-константа скорости комплексообразования фермента с растворимым
ингибитором k~2-константа скорости диссоциации комплекса фермент -
растворимый ингибитор [L] -равновесная концентрация лиганда La -начальная
концентрация лиганда в геле т - число операций элюирования п -число
промывок
Pf-фактор очистки (отношение относительного содержания выделенного
фермента в белке к такой же величине в исходном растворе)
R-фракция выделенного фермента, определяемая уравнениями (3.27) или
(3.28) v - объем фазы геля, доступной для проникновения молекул белка v'
-истинный объем фазы геля
V - начальный объем раствора фермента, добавляемого к гелю
V' - объем элюента w - объем промывного раствора
р - отношение V'/v е> -отношение V/v
3.2 ТЕОРИЯ КООПЕРАТИВНОГО СВЯЗЫВАНИЯ В РАМКАХ ТЕОРИИ ТАРЕЛОК*
Вывод уравнений и моделирование кривых элюирования проведены Окадой и др.
[11] на основании данных кооперативного элюирования олигоадениловой
кислоты с агарозы с присоединенной полиуридиловой кислотой.
3.2.1. Изотерма связывания олигоадениловой кислоты с полиуридиловой
кислотой
Содержание спиральной структуры в полиуридиловой кислоте можно выразить с
помощью следующего уравнения [1]:
Qu=NclcJ'(c) (3.29)
* Список обозначений см. на стр. 42.
Теория аффинной хроматографии
37
ИЛИ
c=c+cu/N Ов.
(3.30)
Найдено, что привязка полиуридиловой кислоты к агарозе происходит по 5'-
концу. Согласно этому, а также принимая во внимание другие данные, по-
видимому, можно предположить, что им-
Рис. 3.8. Изотерма комплексообразования полиуридиловой кислоты с
олигоадениловой кислотой при 5 °С, pH 7,0 в 0,033 М фосфатном буфере,
содержащем 1 моль/л NaCl и 1 ммоль/л MgCl2.
и - в растворе; концентрация полиурндн-ловой кислоты 3,7¦ 10-3 моль/л; б
- в геле после промывки раствором с pH 10.0; концентрация полиуридиловой
кислоты 4.9Х X ДО-1 моль/л; в -в геле до промывки раствором с pH 10,0;
концентрация поли}ридм-ловой кислоты 1.2-10~4 моль/л. Пунктирная кривая
построена теоретически. Ордината указывает долю спиральной формы поли-
уриднловой кислоты при стехиометрическом соотношении адениловая кислота:
уридило-вая кислота =* I ! 2.
мобилизованная полиуридиловая кислота имеет ту же конформацию, что и в
растворе, и поэтому функцию разделения системы можно рассчитать обычным
способом, если полагать для несвязанного олигомера и незанятого участка
связывания на аффинном сорбенте функцию разделения равной единице. Если
си^>с, перекрыванием двух связанных олигомеров можно пренебречь. Окада и
др. [11] ограничили анализ короткими олигомерами и предположили
осуществление связывания олигомера с полиуридиловой кислотой по типу "все
