Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
качестве вещества, подлежащего выделению, принимался фермент. Однако те
же закономерности безусловно справедливы и для любого другого соединения.
3.1.1. Равновесная модель для сорбции с постоянной константой связывания
Основной предпосылкой для проведения аффинной хроматографии является
образование специфического комплекса EL между выделяемым ферментом Е и
аффинным лигандом L, связанным с нерастворимым носителем. Применимы
следующие уравнения:
EL
(3.1)
и
к . [Е][L]
L~ (EL] '
(3.2)
* Список обозначений см. на стр. 35.
Теория аффинной хроматографии
21
где Къ - константа равновесия взаимодействия лиганд - фермент в ходе
сорбции. Туркова и др. [16] исследовали достижение равновесия при сорбции
химотрипсина на N-бензилоксикарбонилгли-цил-о-фенилаланил-ЫНг-сфероне в
зависимости от pH и ионной силы в одноразовом процессе (рис. 3.!). Видно,
что во всех случаях равновесие достигалось в течение ^ 1 ч. Порат и
Кристиан-
Рис. 3.1. Сорбция химотрипсина Z-Gly-D-Phe-МНг-сфероном в зависимости от
pH (а) и ионной силы трис-HCl-буферного раствора (б) [16].
/ - 0,1 М трис-НС1-буфер (pH 8,0); 2 - 0,! М трис НСЬбуфер (pH 7,2); 3 -
0,1 М трнс-мале-ат-буфер (pH 6,0); 4 - 0,05 М трнс*НС1-буфер (pH 8,0); 5
- 0.1 М трис-НО-буфер (pH 8,0); 5 - 0,25 М трис-НС1-буфер (pH 8.0); 7 -
0,35 М трис-HCl буфер (pH 8,0); fl - 0,5 М трнс-НС1-буфер (pH 8,0); J-l М
трис-НСЬбуфер (pH 8.0).
сен [13] обнаружили зависимость скорости сорбции трипсина на
иммобилизованном ингибиторе трипсина из соевых бобов от концентрации
сорбируемого фермента. Это явление детально обсуждается в гл. 10 (рис.
10.4). Лоу и др. [7] сопоставляли количества лактатдегидрогеиазы,
сорбируемые на Ы6-(6-аминогексил)-5/-АМР-сефарозе в колонке и в
одноразовом процессе. В то время как в колонке 100%-ное связывание
фермента достигается в течение 1 ч, в одноразовом процессе для этого
необходимо 16 ч. Результаты одноразового процесса сорбции
лактатдегидрогеиазы на N6- (6-аминогексил)-5/-АМР-сефарозе [8] в
присутствии различных концентраций конкурентного ингибитора NADH показаны
на рис. 3,2. Видно, что при понижении pH, росте ионной силы или
42
Глава 3
в присутствии конкурентного ингибитора равновесие сдвигается в сторону
возрастания концентрации фермента в растворе.
Для того чтобы из уравнения (3.2) вывести другие зависимости, Грейвс и By
[3] сделали следующие допущения. Объем геля v' включает меньший объем v
раствора внутри сетки, построенной полимерными молекулами геля. Перед
добавлением раствора фермента концентрация аффинного лиганда, связанного
в геле, равна L0 (в молях на объем v), а концентрация фермента равна
Рис. 3.2. Одноразовый процесс сорбции лактатдегидрогеиазы на М"-(б-
аминогек-сил)-5'-АМР-сефарозе в присутствии NADH [8],
В стеклянную пробирку (диаметр 14 мм) на плотную марлю (двойной слой,
отверстия 100 мкм), закрывающую открытый конец пробирки" помещалось 0,5 г
ИМб-амииогексил) 5'-АМР-сефарозы (1,5 мкмоль/мл 5''АМР), Пробирка
погружалась в осторожно перемешиваемый инкубационный раствор (10 мл)" из
которого через определенные интервалы времени отбирали пробы (по 50 мкл)
для определения ферментативной активности. Предварительно проводился
диализ фермента в течение ночи против раствора" такого же. как и в
эксперименте, Инкубационный раствор на основе 10 мМ фосфатного (КН2рО<4-
К0Н) буфера (pH 7(5) содержал: / - 0,02% NaN3; 2 - 0,02% NaN3+2 мМ NADH;
5 - 0,02% NaNs+5 мМ
NADH.
нулю. После добавления фермента (объем раствора V, концентрация Ео)
система стремится к равновесию. Равновесная концентрация связанного
фермента [EL] может быть определена уравнением
[EL] = -^- [В| (1 - V1 - А),
(3.3)
где
и
В-.
K^(V±v)
L0v
А =
4 E0V
?%,v ¦
Предположив, что А С I, соотношение можно упростить:
V\^A " 1 - (Л/2).
(3.4)
(3.5)
6)
Теория аффинной хроматографии
23
Тогда уравнение (3.3) сводится к выражению
[EL] ~ Ki (V -f v) + + E9V ¦ (3-^
Ошибка, возникающая в результате принятого приближения, составляет ~2,6%
для Л = 0,1, ~5,2% для Л = 0,2 и -17,1 % для А = 0,5. Величина В,
определяемая уравнением (3.4), обычно близка единице; если допустить, что
В=1, то из уравнения (3.5) получаем, что Л равно учетверенному отношению
числа молей фермента к числу молей лиганда. В обычных условиях
концентрация фермента в растворе составляет ^ 10-5 моль/л, а типичная
концентрация лиганда в фазе геля обычно 10-2 моль/л. Следовательно, при
разумном соотношении объемов раствора V и геля ошибка, вносимая
аппроксимацией, весьма мала.
С учетом принятых приближений при достижении равновесия долю связанного
фермента (относительно общего количества фермента) можно определить
следующим образом:
Связанный фермент [ELJ0 л, Lnu ,0
Весь фермент ~~EjT ^ Kh (V + v) + Lnv + EaV ' ^
В большинстве случаев в знаменателе уравнения (3.8) E0V много меньше
суммы двух других слагаемых и им можно пренебречь.
Уравнение (3.8), следовательно, можно использовать для оценки
эффективности связывания при данных параметрах Къ, Е0, Е0г V и V. В
