Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
элюировании фенолового крас-
(4.1)
46
Глава 4
[L] -W5, медь/л
Рис. 4.1. Хроматография нуклеазы на тимидин-З'- (л-сефароза-
амипофенилфосфат)-5'-фосфате (pdTpAP-сефарозе) [7]. а - зависимость от
концентрации связанного лиганда [L]. Готовились смеси pdTpAP-сефаро-зы
(аффинной матрицы) с ^модифицированной сефарозой 4В (в мл/мл): / - 5,0:1;
2 - 2,5:2.5; 5 - 2:4; 4 - 1,5:4,5; 5- 1:4; 6 - 0,5:4,5. Колонки (объемом
0,5 мл) наполнялись эти^ ми смесями и уравновешивались 51(Г{ М
тнмнднН'Зг,5'-бнсфосфзтоы (pdTp); на колонки на носились образцы нуклеазы
(по 200 мдг); для элюирования использовался 0.1 № NH^aueTaT-мый буферный
раствор, содержащий 5*Ю_а моль/л pdTp. AAjw мин-1* мл - активность
нуклеазы по гидролизу ДНК спермы лосося;
6 - зависимость объема элюирования от концентрации иммобилизованного
аффинного
лиганда,
ного с той же колонки или при элюировании нуклеазы с колонки того же
объема, заполненной немодифицированной еефарозой. На основании уравнения
(4.1) тангенс угла наклона кривой на рис. 4,1,6 дается соотношением
Тангенс угла наклона = ¦ (Т2)
(1+тгг)
Следовательно, если известны одна из констант (Kl или /(i) и тангенс угла
наклона, то может быть рассчитана и другая константа.
На рис. 4.2 показана зависимость объема элюирования нуклеазы от
концентрации растворимого нуклеотида. Во всех опытах вводилось одинаковое
количество нуклеазы в колонки pdTpAP-ce-фарозы, предварительно
приведенные в равновесие с растворами pdTpAP в различных концентрациях:
для элюирования использо-
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 47
вали растворы pdTpAP в адекватных концентрациях (рис. 4.2,6), При
понижении концентрации ингибитора [I] пик белка становился шире и белок
на колонке задерживался дольше.
Уравнение (4.1) можно преобразовать:
1 1______ [II
V-V* ,v Vs\±L'K,v
(м) - Ущ)" yfL *4 - 1'MU' ^
I
(4.3)
На рис. 4.2,6 построена зависимость ^от [I] по данным,
V V(>
полученным на основании объемов элюирования (рис. 4.2,а):
Тангенс угла наклона = 1 !К\А, (4.4)
Отрезок, отсекаемый на оси ординат=1/Л, (4.5)
где A =(V0-1/,") ([L]//Cl).
Из уравнений (4.4) и (4.5) следует, что частное от деления отрезка,
отсекаемого на оси ординат, на тангенс угла наклона равно Ki- В выражение
для отрезка, отсекаемого на оси ординат (рис. 4.2,6), входит Kl, и
поэтому, если [L], Vo и Vm известны, Kl можно рассчитать. В табл. 4.1
приведены значения Ki и Kl. определенные этим методом, они сопоставлены
со значениями Кь полученными из кинетических измерений или из данных
равновес-
Таблица 4,1
Константа диссоциации комплекса аффинного лиганда со стафилококковой
нуклеазой (pH 7,5, в присутствии 10 мМ СаС12)
/С], ноль/л
Аффинный лиганд Хроматогра- фия(r) Кинетика^ Kl> моль/л
Тимн вт-3/-(п-аминофенилфосфат)-5'- 2,3-10-(r) 2,5-10-* 1,1-ю-*
чмтфосфат 5,9-10-(r)
Тим" цш-3',5'-бисфосфат 2,5-10-(r)г 1,0-10-(r)
Тимп.шн-5'-монофосфат Тимиднн-3'-фосфат-5'-(ц-нитрофенил- 1,6-10-(r)
2,8-10-(r) 0,9-10-(r)
1,1-10-(r) 6,3- ю-(r)д 0,6-10-6
фосфаг)
Тим11лин-3'-(п-ннтроф<'нилфосфат)-5'- 4.1-1И 3,5-10-* 2,6-10-*
фосфат
Тимилнн-З'-См-ннтрофеннлфосфат) Без лш-анда 4,3-10-* 1.5-Ю-*
1,2-10-*
фатом
р
±30%; по данным конкурентного элюирования.
•J. 30%; значения определены по графику Диксона [5],
ь50%; для связывания нуклеазы с тимидин-ЗМл-сефароэа'амннофенилфосфатЬй'-
фос*
23%; по данным равновесного диализа, д к
для ферментативного отщепления л-нытрофенилфосф&тз.
48
Глава 4
ного диализа. На основании соответствия между этими константами можно
сделать вывод, что в этой системе связывание нуклеазы на аффинной матрице
полностью обратимо и что иммобилизация лиганда не ограничивает
комплексообразования.
Номер фракции.
[pdTpAP] ¦ 10 f моль!к
Рис. 4.2. Хроматография нуклеазы на тимидин-З'-(я-сефароза-
аминофенилфосфат)-5'-фосфате (рс1Тр^сефарозе) [7].
а - зависимость от концентрации растворимого тимидин-Э''(л-
амннофеиклфосфат1-5'-фосфа га {pdTpAP) в элюирующем буферном растворе. На
колонки наносились образцы нуклеазы (по 200 ыкг); колонки предварительно
уравновешивались 0,1 М. ацетатом аммония, содержащим pdTpAP (моль/л):
/ - 0,5-Ю"Б: 2 - 0,75-10-*; 3 - 1.0-КН; 4 - 2-10-*: 5 - 3-Ю"5;
€ - -4,0-10-для элюирования использовались растворы соответствующего
состава; б - зависимость 1 /{V- V0) от [pdTpAP] (уравнение {4.3)1;
коэффициент корреляции г = 0.997. Чтобы не загромождать рисунок, кривая
элюирования для fpdTpAP]~5*HH1 моль/л не приведена на рис. 4.2, я, однако
учитывалась при построении рис. 4.2, б.
По данным определения фосфата в кислотном гидролизате pdTpAP-сефарозы
установлено, что концентрация pdTpAP в модифицированной сефарозе
составляет 2,1-10 4 моль/л. Однако из расчета констант диссоциации
следовало, что концентрация pdTpAP, определенная из операционной емкости,
соответствует 5 -10^5 моль/л. Из сравнения этих величин следует, что
только
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 49
