Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
фермента). Если пренебречь членом (1 + р), то при /Cl = 10-3 моль/л
ошибка составит - 10%, а при более низких Kl она много ниже.
Следовательно, вместо Ki и Kl можно рассматривать только их отношение:
Г' [EI] / Р \ Г р/р
\ Р + 1 ) р/0 + KiLo/Kl
(3.28)
Рис. 3.6 является графической иллюстрацией уравнения (3.28) при -Со = 10
ммоль/л и р=1 и 10. Очень важный параметр здесь - отношение констант
равновесия для свободного и связанного инги-
32
Глава 3
битора KiIKl. Если это отношение равно единице, концентрация ингибитора в
элюенте, необходимая для эффективного элюирования фермента, должна быть
равной 10-100 ммоль/л (предполагается, что концентрация лиганда в геле
всегда 10 ммоль/л). Концентрация ингибитора и отношение Ki/Kl -
взаимозависимые величины. Если растворимый ингибитор связывается в 10 раз
сильнее, чем лиганд, то его необходимая концентрация в растворе
понижается примерно на порядок, если же он связывается в 10 раз
[/]0 ,мо/гь/л
Рис. 3.6. Выход фермента при элюировании растворимым ингибитором [3].
Сплошные линии - V': и -10, пунктирные - V'; Без стадий промывки.
Соотношение
объемов элюирования сильно влияет на общий выход фермента, который можег
быть достигнут,
слабее, то необходимая концентрация растворимого ингибитора становится
равной 0,1-1 моль/л. На элюировании фермента с аффинного сорбента
растворами растворимого ингибитора в различных концентрациях основан
наиболее распространенный в настоящее время метод определения констант
равновесия выделяемого со связанного ингибитора фермента. Практические
примеры применения этого метода детально рассмотрены в гл. 4.
3.1.4. Математическое моделирование результатов колоночной
хроматографии
Сорбция, промывка и элюирование ферментов с использованием колоночной
аффинной хроматографии описываются с помощью уравнений, выведенных для
модели одноразовой сорбции и элюирования путем изменения Kl (рис. 3.7).
Из рис. 3.7, а хорошо видно, что при моль/л значительная потеря
фермента
(61,6%) происходит при промывках. Элюирование при KL, равных
Теория аффинной хроматографии
зз
Связывание
Суммарный объем промывок и злюиравания,
{ZV- Zw)/V
Рис. 3.7. Математическое моделирование результатов колоночной
хроматографии [3].
о - плохое связывание -10-' моль/л); элюирование осуществляется в
результате изменения К|' на Kl; существенная потеря фермента происходит
при промывках; б - хорошее свя-зывавие fК^ =10-* моль/л); при промывках
теряется мало фермента; в-очень хорошее Связывание (KL<10-5 моль/л);
фермент практически не теряется при промывках,
1,0, 0,1 и 0,01 моль/л, освобождает весь сорбированный фермент (38,4%).
На рис. 3,7,6 можно видеть совершенно другое поведение фермента: при
выделении фермента с Кь=Ю-4 моль/л на стадии промывок теряется только
10,3%. При Kl, равных 0,1 или
3-6
34
Глава 3
0,01 моль/л, можно получить до 89,7% фермента. Пои /Сь=Ю_г моль/л выход
составляет ~86,2%, а при Ki= = 10-4 моль/л - только 16%. На рис. 3.7, в
показан очень благоприятный случай при /Cl^10~5 моль/л, когда, по-
видимому, во время промывки никакой потери фермента не происходит.
Элюирование при значениях KL от 10-1 до 10-5 моль/л дает выходы (от
исходного количества фермента) 98,9, 98,9, 95,6, 29,7 и 1,9% после 20
промывок. Высокие значения K'l являются желательными, поскольку при этом
получаются более концентрированные растворы фермента на выходе.
3.1.5. Заключение
Хотя многие выведенные соотношения должны быть уточнены экспериментально,
они уже сегодня полезны, поскольку указывают на аспекты, требующие от
исследователя внимания. Аффинный сорбент с концентрацией связанного
лиганда ~10 ммоль/л следует использовать только для выделения веществ,
константы равновесия которых (с закрепленным аффинантом) s^lO-3 моль/л.
Для систем с более высокими (менее благоприятными) константами равновесия
следует использовать сорбенты с соответственно более высоким содержанием
связанного аффинного лиганда. Однако на практике этому случаю сопутствуют
многочисленные ограничения, которые рассматриваются в гл. 5.
Другим важным следствием рассмотренных выше соотношений является низкое
насыщение молекул иммобилизованного лиганда выделяемым веществом. Для
повышения этого насыщения необходимо проводить сорбцию из как можно более
высоко концентрированного раствора. Низкие проценты насыщения, получаемые
на практике, следует объяснять не только стерическими факторами, но также
и ограничениями равновесного характера.
Из взаимосвязи между промывками и элюированием путем изменения Kl следуют
два важных факта. При Kl^IO'5 моль/л одноразовая сорбция и элюирование
могут привести к тем же, а иногда и лучшим результатам по сравнению с
колоночной хроматографией. При Kl= 10_3 моль/л только при применении
колоночной хроматографии можно получить хорошие результаты. Кроме того,
для эффективного удаления фермента из геля Kl на стадии элюирования
должна достичь значения по крайней мере 10"2 моль/л независимо от Kl.
