Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 10

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 16 .. 198 >> Следующая

пример, в случае белка или пептида по данным количественного
аминокислотного анализа гидролизата. Туркова и сотр. [16], например,
нашли, что только 0,3% молекул N-бензилоксикарбонил-глицил-п-
фенилаланина, связанного с ЫНг-сфероном, насыщается химотрипсином. Лоу и
др. [8] нашли, что для связывания лак-татдегидрогеназы Ы6-(6-
аминогексил)-5/'-АМР-сефарозой емкость ¦сорбента составляет 0,76% при
одноразовом процессе и менее 0,1% при фронтальном хроматографическом
анализе. Подобным образом, Гиеровский и Бродерсен [5] определили, что в
данных экспериментальных условиях лишь ~ '/ю молекул билирубина на
носителе способны связывать сывороточный альбумин.
3.1.2. Равновесная модель для элюирования путем изменения Кi,.
Как указывалось в гл. 2 {рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый
фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом
либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое
элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более
общим: как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния
таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и By [3], выводя
закономерности для освобождения фермента с аффинного
Теория аффинной хроматографии
27
сорбента, сделали следующие упрощающие допущения: изменение ионного
окружения приводит только к увеличению Kl. Одноразовый процесс можно
разделить на шесть стадий: 1) гель объемом v уравновешивается с ферментом
объемом У (константа равновесия Kl) ; 2) У отделяется от о; 3) к v
прибавляется объем (не-элюирующего) промывного раствора (да),
устанавливается новое равновесие (Kl не изменяется); 4) w отделяется от
v, при этом удаляются белки-примеси, которые сорбировались в геле (также
частично теряется фермент, как связанный, так и включенный); 4а) третья и
четвертая стадии повторяются, если необходимо довести количество примесей
до низкого уровня; 5) к и прибавляется объем V' элюента и устанавливается
новое равновесие с более высокой константой KL; 6) V' отделяется от о и
при этом получают чистый фермент. Чтобы повысить выход фермента, можно
повторить пятую и шестую стадии, однако на практике элюирование не
повторяется несколько раз.
Элюирование фермента без стадии промывки
Вывод соотношений, описывающих процесс элюирования, аналогичен выводу для
процессов адсорбции. Однако, поскольку процесс элюирования более сложный,
Грейвс и By исходили лишь из приближения (3.6).
Из уравнения (3.9) найдено выражение для суммарного количества фермента,
оставшегося в У, содержащегося в У7 и включенного в и:
Включенный фермент + Фермент в V и V' ^
Весь фермент
^ j (Klv + V]____________________ /3 12\
~ 1*ц(У+о + ад [*L(V' + ")+?""]•
Для фракции фермента, содержащейся в элюате аффинного сорбента,
предложено следующее выражение:
Фермент в V ^ / V \ I j L0v (Kit) -j- /.0t>)
Весь фермент V'+ v J ( ~ [tfL (V + v) + L0v] [< (V + v) + i.0c] ~
+ ]}¦ <ЗЛЗ)
Этот вывод полезен для понимания всего процесса. Заслуживает внимания то,
что выход фермента в значительной степени зависит от отношения V'lv и
менее зависим от V/v. Уравнение (3.13) для выхода фермента графически
выражается в асимптотическом приближении к пределу (рис. 3.5,а), даже для
фермента с очень высокими значениями Kl- Из графика следует, что
неблагоприятны-
28
Глава 3
ми для выделения являются /Сь> 10-3 моль/л, однако трудности возникают и
при слишком низких значениях Kl, поскольку часть фермента может при этом
оставаться в гелевой фазе и после элюирования. Более того, из рис. 3.5, а
ясно, что при значительном различии между величинами Kl и KL выделение
фермента происходит более легко. На рис. 3.5,а приведен также фактор
очистки
Рис. 3.5. Выход фермента и фактор очистки без стадий промывки для
отношения ¦объема образца к объему геля 1 : 1 (а), и при 10-кратной
промывке для отношения объема элюирующего раствора к объему геля 10:1
(б) [3].
(Pf), который определяется как отношение выделенного фермента к общему
количеству белка, деленное на исходное отношение фермент-белок. При
освобождении фермента с аффинного сорбента, не включающем стадию
промывки, Pf очень низок. Очевидно, что без стадий промывок очистка не
эффективна, даже с благоприятно низкими величинами Kl и достаточно
высокими величинами К l, поскольку полученный фермент загрязняется
белками.
Оценка эффективности промывок, приводящих к уменьшению примесей, проста:
Примесный белок в элюате Г нЩ 1 Г v "И ,
Весь примесный белок I (V + u) (V'v) ш + и I * ^ '
Лучше промывать несколько раз небольшими объемами, чем -один раз большим.
Это уравнение указывает также на преимуще-
Теория аффинной хроматографии
29
ство колоночной хроматографии: постепенное пропускание элюен-та через
колонку равносильно элюированию с большим числом промывок (я).
Элюирование фермента после нескольких промывок
Определение выхода фермента осложняется тем, что он связан с лигандом и в
то же время физически включен в объем геля. Для расчета суммарного
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 16 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed